1.掌握测定血清胆红素的原理与方法。
2.深入了解胆红素的生理作用。
二、实验原理
血清与醋酸钠—咖啡因—苯甲酸钠试剂(咖啡因试剂)混合后，加入氯化重氟苯磺酸(重氮试剂)，生成紫红色偶氮胆红素，最后加入强碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素。醋酸钠缓冲液保持偶氮反应的pH；咖啡因试剂中苯甲酸钠—咖啡因促进未结合胆红素溶解，破坏游离胆红素分子内的氢键，加速与重氮试剂的偶联反应；叠氮钠(或抗坏血酸)可终止结合胆红素的偶氮反应。反应结束后，在600nm 波长比色，从标推曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
三、仪器和试剂
仪器
可见光分光光度计
试剂
1. 咖啡因试剂 无水醋酸钠82g，苯甲酸钠75g，EDTANa2l.0g，溶于约500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因50g，搅拌至完全溶解，然后加蒸馏水稀释至1000mL，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。
2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。
3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸5.0g，加于约800mL 蒸馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。
4. 重氮试剂临用前，取试剂20.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液20mL 混合。
5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
6. 碱性酒石酸钠溶液：氢氧化钠75g，酒石酸钠(含2分子水)263g，加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，混匀，置塑料瓶中，室温保存可稳定6个月。
7. 342μmol/L 胆红素标准液：收集不溶血、无黄疽、清晰的血清作为混合血清稀释剂。混合血清稀释剂应符合下列要求：混合血1.0mL，加生理盐水24mL，混匀。在分光光度计中，以比色杯光径1cm，波长414nm，用生理盐水调零，读取的吸光度应小于0.100，波长460nm 处读取的吸光度应小于0.040。
四、操作步骤
(一)胆红素标准曲线的绘制
称取符合标难的纯胆红素(MW584．68)20.0mg，加二甲亚砜4mL 溶解。在50mL 容量瓶中，加入混合血清稀释剂约40mL，缓慢加入上述胆红素二甲亚砜溶液2mL，边加边混匀，尽量避免产生泡沫，然后补加混合血清，稀释至刻度，混匀。该标准液应避光置冰箱，可保存数天。但最好用于当天绘制标准曲线。
按表下表配制五种不同浓度的胆红素标准液，表中各管充分混匀．然后按照血清总胆红素方法进行测定。每一浓度平行做3管，以各浓度管吸光度值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标，作图，绘制出标准曲线。
(二)胆红素的测定
按表下表的顺序与加量进行操作。结合胆红素管在加入重氮试剂混匀后准确1min，加入5g/L 叠氮钠溶液0.05mL 和咖啡因试剂1.6m1，混匀，总胆红素管室温放置10min，然后向各管加入碱性酒石酸钠1.2m1，混匀，用分光光度计660nm 波长，以空白管调零，读取各管吸光度，从标准曲线上查出总胆红素和结合胆红素浓度。
