四、操作步骤
(一)菌体培养及样品的准备
1.菌体培养：以枯草芽孢杆菌为例。
培养基成分为：1％蛋白胨，0.5％氯化纳，1％牛肉汁，调pH 至7.2。
将培养基装入500mL 三角瓶内，每瓶100mL，灭菌，5.52×10Pa，30分钟。灭菌后的培养基冷至约30℃，用接种环取菌株一环，接种于培养基内。摇床培养，30℃/22h。
收集菌体：将细菌连同液体培养基，4500r/min，离心10分钟并用0.8％生理盐水洗涤菌体两次。
2.菌体细胞壁的提取
取3g 菌体，加20 mL 水，超声处理10 min(功率150w)。将超声处理后的悬液4000r/min，离心10分钟，弃去沉淀(其中包含完整的细胞)，收集上清液，于15000g 离心15 min，弃去上清液，将沉淀物悬浮于5mL0.05mol/L 的pH7.6磷酸盐缓冲液中，加RNA 酶，按0.5mg/mL 于37℃消化1小时。然后于25000g离心15min，弃去上清液，将沉淀物用水洗涤一次。再悬浮于5mL0.05mol/L 的pH7.6磷酸盐缓冲液中，加胰蛋白酶(trypsin)0.5g/mL，于37℃消化3h。然后离心，弃去上清液，将沉淀用水洗涤3次，即得纯净的细胞，于冰箱内保存备用。
3.细胞壁的水解
取4g 细胞壁．放入安瓶管内，加入0.4mL2moL 的盐酸，封口维持100℃，水解2小时。室温冷却，开管。用氢氧化钠和浓硫酸做干燥剂，进行真空干燥。点样前加0.1mL 水，将干燥的样品溶解，用氨水调pH 至中性。
(二)样品在硅胶H 薄层上的径向层析
1.硅胶H 薄层板的制备
取5cm×15cm 的玻璃板一块，洗净，烘干，放在水平台面上。取1g 硅胶H，放在小研钵中，加 3.4mL0.5％羧甲基纤维素(CMC)溶液(起粘合作用)．加4~5滴95％乙醇(消除泡沫)，研磨数分钟后，将研好的浆液倒在预先准备好的玻璃板上．用玻璃棒将浆液铺开，再将玻璃板拿起稍加振动，使浆液分布均匀，放在水平台面上，待水分蒸发后，置105℃烘箱中，活化30min。薄层厚度约为0.25mm。
按照右图中的图形和规格，在硅胶H 薄层上用刀片刮去图中阴影所示部位，使硅胶H 薄层上呈现一个细的颈部，此板即为径向湾层层析板。径向薄层层析的优点是，样品展层后图谱呈弧形带状，Rf 值相近的化合物也能清楚地分开。如此制作4~6块薄层板，备用。
图3－3 径向薄层板的规格
