(二) 胰蛋白酶粗操液的制备
取50g 猪新鲜胰脏(除去脂肪和结缔组织)剪碎置于高速组织捣碎机内，加入200mL预冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，匀浆。于10℃提取4小时以上，4层纱布过滤，收集滤液并用5mol/L 的氢氧化钠调至PH8.0，加入终浓度为0.1mol/L 氯化钙及1~2mg 胰蛋白酶晶种，置4℃激活12~16小时或在室温(25℃左右)激活2~4小时。待胰蛋白酪比活达到1000~1500 BAEE 单位／mg 以后，用6mol/L 硫酸调至pH3.0停止激活。
放置4℃冰箱内备用。测定胰蛋白酶活性。
(三)亲和层析纯化胰蛋白酶
取一支层析柱(10mm×100mm)，装入少量亲和柱平衡液(0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙0.1mol/L，pH7.8 Tris—HCl 缓冲液)，将亲和吸附剂一次装入柱内，待亲和吸附剂自然沉降至约1/2总体积后，调节合适的流速。用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液．待基线达到稳定后即可。
取一定体积的蛋白酶粗提液(30－50mL，视酶液的蛋白浓度及比活而定)调至pH8.0．用滤纸过滤，取滤液上柱吸附，然后用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液，待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液(0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液)洗脱。收集洗脱峰2，测定酶蛋白含量及活性，
层析图谱，如图3—9。
图3—9 亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线
平衡液：0.5mol/L 氯化钾，0.05mol/L 氯化钙，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 缓冲液。
洗脱液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液。
(四) 胰蛋白酶的保存
经亲和层析分离得到的胰蛋白酶，一般是比较纯的酶，但是酶蛋白的浓度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的无机盐，然后冰冻干燥成粉末，长期保存。也可将酶溶液放在－20℃的冰箱冰冻保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存两年左右。
(五)结果处理
