(2)聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺(acrylamide)与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度,就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Laboratories 生产,商品名为Bio-Gel P,主要型号有Bio-Gel P-2 ~ Bio-Gel P-300等10种,后面的数字基本代表它们的排阻极限的103,所以数字越大,可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4×105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好,在pH 为1~10之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下,聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水,基本不带电荷,所以吸附效应较小。另外,聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用,使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。
(3)琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖,它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D-半乳糖(D-galactose)和3,6-脱水半乳糖(anhydrogalactose)交替构成的多糖链。它在100 °C 时呈液态,当温度降至45 °C 以下时,多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖,经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异,常见的主要有Pharmacia Biotech 生产的Sepharose(2B ~ 4B)和Bio-Rad Laboratories 生产的Bio-gel A 等。琼脂糖凝胶在pH 为4-9之间是稳定的,它在室温下很稳定,稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好,一般好于前两种凝胶,在高盐浓度下,柱床体积一般不会发生明显变化,使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大,分离范围很广,适合于分离大分子物质,但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温,使用温度以0-30°C 为宜。
Sepharose 与2,3二溴丙醇反应,形成Sepharose CL 型凝胶(CL-2B ~ CL-4B),它们的分离特性基本没有改变,但热稳定性和化学稳定性都有所提高,可以在更广泛的pH 范围内应用,稳定工作的pH范围为3-13。Sepharose CL 型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。
(4)聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶
这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB 提供,商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺,所以有较高分辨率;而它又含有琼脂糖,这使得它又有较高的机械稳定性,可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel 有不同的分离范围,
(5)多孔硅胶、多孔玻璃珠
多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义,它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶,它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好,使用方便而且寿命长,无机胶一般柱效较低,但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC 柱也可以有很高的柱效,可以达到4×104塔板/米。多孔玻璃珠易破碎,不能填装紧密,所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽,多孔硅胶一般为102-5×106,多孔玻璃珠一般为3×103-9×106。它们的最大缺点是吸附效应较强(尤其是多孔硅胶),可能会吸附比较多的蛋白,但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液,一般使用时pH 应小于8.5。
另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快,目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如Pharmacia Biotech 的Superdex 和Superrose,Superdex 的分辨率非常高,化学物理稳定性也很好,可以用于FPLC、HPLC 分析;而Superose 的分离范围很广,分辨率较高,可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。
凝胶的选择、处理和保存
(1)凝胶的选择
通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别,所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶,这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。
一般来讲,选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围,根据分离范围来选择合适型号的凝胶。一般的凝胶层析实验可以分为两类:分组分离(group separations)和分级分离(fractionations),分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组,一组分子量较大,另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶,这样分离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型。分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型,凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量,另一方面要合适,不能过大。如果分离范围选择过小,则某些组分不能得到分离;如分离范围选择过大,则分辨率较低,分离效果也不好。


