④洗脱
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如图2－22。我们可以通过下式计算得到流经层析柱的洗脱液中盐浓度：
C = C_B－( C_B－C_A)( 1－V₂ / V₁)B₁ / A₁
式中： C：流经层析柱的洗脱液的盐浓度；
C_B：梯度混合器中B 瓶的盐浓度(不搅拌)；
C_A：梯度混合器中A 瓶的盐浓度(搅拌)；
B₁：B 瓶的横切面积； A₁：A 瓶的横切面积；
V₂：流经层析柱的洗脱液体积； V₁：梯度洗脱液总体积。

图2－22 柱层析中形成洗脱液梯度的三种形式示意图
A：混合液(低浓度盐溶液)；B：储液瓶(高浓度盐溶液)
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整(可以用正交试验或优选法)，才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。
⑤收集、鉴定及保存
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1mL~5mL/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL / 管，这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冷冻干燥得到干粉，在低温下保存备用。
⑥基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生
许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用。各种基质的再生方法可参阅有关文献。

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