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层析技术(概念、分类、操作等)
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-22

    迁移率(或比移值)是指:在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf 来表示。(Rf 大于或等于1)可以看出:K 增加,Rf 减少;反之,会减少,Rf 增加。
    实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指:在一定条件下,在相同时间内,某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1,也可以大于1。用Rx 来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然,差异越大,分离效果越理想。
    分配系数主要与下列因素有关:①被分离物质本身的性质;②固定相和流动相的性质;③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式:
    lnK = -(ΔG0/RT)
    式中: K 为分配系数(或平衡常数);
    ΔG0为标准自由能变化;
    R 为气体常数;
    T 为绝对温度。
    这是层析分离的热力学基础。一般情况下,层析时组分的ΔG0为负值,则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20℃,K 值下降一半,它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K 值相近的不同物质,可通过改变温度的方法,增大K 值之间的差异,达到分离的目的。
    (4)分辨率(或分离度)
    分辨率一般定义为:相邻两个峰的分开程度,用Rs 来表示,如图2—20。

    图2-20 计算分辨率示意图
    VR1—:组分1从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积。
    VR2—组分2从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积。
    W1—组分1的洗脱峰宽度。
    W2—组分2的洗脱峰宽度。
    Y—组分1和组分2洗脱峰值处洗脱液的总体积之差值。
    分辨率:

    由上式可见,Rs 值越大,两种组分分离的越好。当Rs = 1时,两组分具有较好的分离,互相沾染约2%,即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时,两组分基本完全分开,每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时,这时 为了提高分辨率Rs 的值,可采用以下方法:
    ①使理论塔板数N 增大,则Rs 上升。
    1)增加柱长,N 可增大,可提高分离度,但它造成分离的时间加长,洗脱液体积增大,并使洗脱峰加宽,因此不是一种特别好的办法。
    2)减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸,并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm;而HPLC 柱子的固定相颗粒为10mm
    以下,且压力可达150kg/cm。它使Rs 大大提高,也使分离的效率大大提高了。

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