b 的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶a 与b 的重量比应在30左右。选择T 和C 的经验公
式是：
C = 6.5－0.3T
此式可用于计算T 为5％～20％时的凝胶组成。C 值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 ±1％，当C 保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T 的增加而减小，当T 保持恒定，C 为4％时，有效孔径最小，C 大于或小于4％时，有效孔径均变大，C 大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C 是2.6％和3.0％。
配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。
聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：①可以随意控制胶浓度”T”和交联度”C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子；②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：
10－9 ～10－12 mol/L；③由于聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生”电渗”；④由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好；⑤透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存；⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析；⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，玻璃管通常直径为7 mm，长10 cm，将凝胶装入到多个管中进行电泳，又称为柱状电泳。目前仍有应用，尤其用于二维电泳中的第一维电泳。
但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异，所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛，常用于蛋白质及DNA 序列分析过程中DNA 片段的分离、鉴定。
水平平板电泳近年来也有很快的发展，与垂直平板电泳相比也有其独特的优点：①由于凝胶可以直接铺在冷却板上，容易使凝胶冷却，因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快，通常只要1小时左右，而圆盘电泳和垂直平板电泳一般需要3～4小时。③因为可以使用薄胶，加样少，染色快，从而提高了灵敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式，用途广泛，尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术，即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液，大大节约了试剂，简化了操作，提高了电泳速度。
ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS－PAGE 是在电泳样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的样品处理液的一种电泳方法。SDS即十二烷基磺酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+)，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS 与蛋白质结合后使蛋白质－SDS 复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS 分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS 掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶(孔径较大)；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶(约1cm)，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径(丙烯酰胺浓度通常为3～5％)，各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH 值较低(通常pH = 6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
