荧光光度分析
荧光原理
基态分子吸收特征频率的光能后被激发，这些激发分子中的电子很快(＜10－15s＝由基态跃迁到激发态，激发态电子很不稳定，它会迅速降低而返回到第一电子激发态的最低振动能级。
然后再由这一能级返回基态的任何振动能级。在后一过程中，激发态电子以光的形式放出它们所吸收的能量，所发出的光称为荧光。荧光物质分子所吸收的特征频率的光称为激发光，如图2—14。
荧光光谱(fluores cencespectrum)是带光谱。其发射光谱的形状往往与激发光波长无关；但其发射光谱和吸收光谱的形状相似，且呈镜像对称关系。荧光的激发光谱与发射光谱是荧光分光光度分析的基本参数和依据。同时，荧光物质在吸光之后发射出的荧光强度也是最常用的荧光参数之一，它是表示荧光发射强弱的物理量。目前，一般商品荧光分光光度计都采用荧光强度来表示，单位为任意单位表示的相对强度。荧光物质发射的荧光强度与它吸收的光能成正比。
荧光分光光度法的应用
荧光分析大致可分为直接测定法和间接测定法两种。直接测定法是利用物质的自身荧光来进行测定，而间接测定法是由于许多有机或无机化合物自身不产生荧光或发射的荧光很微弱，无法直接进行测定，只能用间接的方法进行测定。常用的间接测定法有化学反应法、荧光猝灭法和敏化发光法等。
(1)直接荧光检测
有些样品自身可以产生荧光，可以直接进行荧光检测，像少数氨基酸如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和部分蛋白质、核黄素、水杨酸钠等自己可以发出荧光，这就是直接荧光测定方式。在对成分复杂的生物样品进行直接荧光检测前，往往需要利用萃取、沉淀、过滤、色谱等方法对样品加以纯化，以去除或减少杂质的干扰，降低荧光本底，提高检测灵敏度。
(2)间接荧光检测
有些物质本身荧光很弱，或不发荧光，需要使其转化成荧光物质再进行检测，就是间接荧光检测。
①化学反应引导的荧光检测
利用化学反应可使一些自身荧光很弱或不能产生荧光的化合物转变成荧光化合物。例如测定血浆或脑组织中的吗啡时，利用氧化还原反应，将含吗啡的提取液pH 调节至8.5，加K3Fe(CN)6使吗啡氧化为二聚物，可产生很强的荧光(350／440nm)，在0.1~8μg／mL 血浆浓度范围内成线性。根据测定物的不同化学特性，可利用水解反应、缩合反应、络合反应、光化学反应、H2SO4引导荧光等不同化学反应，把它转变成相应的荧光化合物。
