(三) 原生质体融合
1. 除酶
取两亲本原生质体各1 mL，混合于灭菌小试管中，2500 r/min 离心 10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。
2. 促融
向上述沉淀菌体中加入0.2 mL SMM 溶液，混合后再加入1.8 mL 40％PEG，轻轻摇匀，32℃水浴保温2 min 立即用SMM 溶液适当稀释(一般为10⁰、10^-1、10^-2)。
3．再生
取融合后的稀释液各0.1 mL，放于冷却至45℃左右的6 mL 固体再生基本培养基试管中，迅速混匀，倒入带有底层再生培养基的平板上，每个稀释度做两次重复，30℃培养96 h，检出融合子。
4．融合子的检验
用牙签桃取原生质体融合后长出的大菌落点种在基本培养基平板上，生长者为原养型即重组子。传代稳定后转接于固体完全培养基斜面上，而亲本类型在基本培养基上是不生长的。

附录 酵母原生质体融合试验用培养基
(包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合）
1. 完全培养基
葡萄糖 2 g
蛋白胨 2 g
酵母膏 1 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 灭菌20 min。
如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。
2. 基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验)
(1) 葡萄糖柠檬酸钠培养基
葡萄糖 0.5 g
(NH₄)₂SO₄ 0.2 g
柠檬酸钠 0.1 g
MgSO₄·7H₂O 0.02 g
K₂HPO₄ 0.4 g
KH₂PO₄ 0.6 g
纯化琼脂 2 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100Pa 灭菌20 min。
(2) YNB 培养基
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
3. 再生完全培养基
在固体完全培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖(或0.8 mol/L 甘露醇或1 mol/L 山梨醇）。
4. 基本培养基(用于电场诱导酵母原生质体融合试验)
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
*YNB 培养基由以下A、B、C 三种溶液混合而成，取A 1 mL，B 1 mL，C 10 mL，无离子水 1000mL， pH6.5。
A 液 维生素混合液VB1 1000 mg，箊酸400 mg，吡哆醇 400 mg，生物素 20 mg，泛酸钙2 000 mg，VB2 200 mg，肌醇10 000 mg，对氨基苯甲酸 200 mg，无离子水l 000 mL，
B 液 微量元素混合液 H₃BO₄ 500 mg，MnSO₄·7H₂O 200 mg，ZnSO₄·7H₂O 400 mg，CuSO₄·5H₂O 40
mg，FeCl₃·6H₂0 100 mg，Na₂MnO₄ 200 mg，无离子水1000 mL，
C 液 其他无机盐KI 0.1 mg，CaCl₂·2H₂O 0.1 g，K₂HPO₄ 0.15 g，KH₂PO₄ 0.85 g，MgSO₄·7H₂O 0.5
g，NaCl 0.1 g，无离子水1000 mL。
5．再生基本培养基
在基本培养基中加入1 mol/L 山梨醇。

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