一、目的要求
学习并掌握以酵母菌为材料的原生质体融合的操作方法。
二、基本原理
进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子。
三、实验材料
(一) 菌种
(三) 缓冲液
(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂
40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容
(一) 原生质体的制备
1．活化菌体
将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞
分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。将二株菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀，分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个平板)，用刮棒涂布，30℃培养48 h 后进行二亲株的总菌数测定。
3. 酶解脱壁
各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1％EDTA 和0.3％SH-OH）于30℃振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。
(二) 原生质体再生及剩余菌数的测定
1．再生
分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再生培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行再生菌数测定(用双层再生培养基)。
2. 未脱壁菌数测定
分别取0.5 mL 原生质体至装有无菌水试管中，稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。
