四、实验内容
(一) 原生质体的制备
1 培养枯草芽孢杆菌
取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。
2. 收集细胞
各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。
3. 总菌数测定
各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。
4. 脱壁
二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。
5. 剩余菌数测定
取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数
(二) 原生质体再生
用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5 mL 原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48 h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。
(三) 原生质体融合
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于
沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，
2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。
(四) 检出融合子
取0.5 mL 融合液，用SMM 液作适当稀释，取0.1 mL 菌液与灭菌并冷却至50℃的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，36℃培养2 d，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。
(五) 融合子的筛选
挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合子。由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种只发生质配，而无核配，形成异核体。两者都能在再生基本培养基平板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定。故在传代中将会分离为亲本类型。所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和选择。
