琼脂表面潮湿，会使菌落扩散，即便倒置平皿培养，也会影响分离结果。注意倾注法制平板时，琼脂温度控制在45℃左右，最好提前1d 制作平板，让水分蒸发或30℃烘干过夜，或培养时用无菌粗陶瓷培养皿盖取代正常玻璃皿盖，也可在玻璃皿盖内层放浸有甘油的滤纸，吸取皿中蒸发的水分，以达防止菌落扩散的目的。
(四) 营养缺陷缺陷型菌株鉴定
1. 营养缺陷型生长谱法鉴定
(1) 将可能是营养缺陷型的菌株，接种于盛有5 mL 完全培养液的离心管中，30℃振荡培养14~16 h。
(2) 将菌悬液3500 r/min 离心10 min，弃去上清液，打匀管底菌团，用无菌生理盐水洗涤菌体3次，最后加5 mL 生理盐水制备菌悬液。
(3) 吸取1 mL 菌悬液，加入无菌培养皿中，倾注约15 mL 融化并冷却至45~50℃的基本琼脂培养基，摇匀待凝，共四皿。
(4) 在培养皿底部划分三个区域，做好标记。在每个区平板表面分别沾上沾有混合氨基酸(或酪素水解液)、混合核酸碱基(或RNA 水解液)、混合维生素溶液、酵母浸出溶液的滤纸片，30℃培养24 h，经培养后若某一类营养物质周围有生长圈，即表明为该类营养物质的营养缺陷型菌株(图 3)。有的菌株是双重营养缺陷型，可在两类营养物质扩散图交叉处看到生长区。
图 3 营养缺陷型生长谱测定
A. 氨基酸混合液；B. 核酸碱基混合液；C. 维生素混合液；D. 混合氨基酸及维生素溶液
2. 营养缺陷型突变株遗传标记的确定
所选出的营养缺陷型可能是氨基酸缺陷型、核酸碱基缺陷型、维生素缺陷型或双重营养缺陷型。氨基酸缺陷型较为常见，可将待测细菌培养至对数期，离心收集菌体，生理盐水洗涤3 次，制成菌悬液后划线接种到9 组含氨基酸的基本培养基平皿上(见表 1)，若在某纵横两组的平板上发现菌生长，根据表1 即可查出是那种氨基酸营养缺陷型。如在第2 组和第8 组平板上长菌，即为赖氨酸营养缺陷型。也可在基本培养基上只加一种氨基酸的平板或基本培养基中只缺一种或几种氨基酸并组合有其他氨基酸的平板，通过划线接种而找出缺陷型。若是核酸碱基或维生素缺陷型，可依上法分别放置浸沾一种营养成分的滤纸片于混菌基本培养基平板上，从平板上生长谱测定鉴定营养缺陷型的类型。
五、实验报告内容
(一) 记录并计算NTG 处理后的杀菌率。
图 4 营养缺陷型筛选过程示意图
[+] 完全培养基；[-] 基本培养基；无N[-] 无N 基本培养基；2N[-] 二倍氮源基本培养基
图2 NTG 处理后的杀菌率
