2. 加青霉素
将上述经饥饿培养的菌液，3500 r/min 离心10 min，加到二倍氮源20 mL 基本培养基中，30℃振荡培养3~4 h，待野生型细胞刚进入对数生长期，对于G+菌加入青霉素的终浓度一般为50~100 u/mL，对于G-加入青霉素的终浓度为500 u/mL(青霉素母液过滤除菌后加入)。若在加青霉索同时，加入无菌的20%蔗糖和0.2% MgSO4(高渗透压培养液可防止野生型菌株因青霉素处理细胞壁裂解后原生质体涨破而提供营养缺陷型突变株营养物质)，再继续培养5~6 h，达到淘汰野生型、浓缩缺陷型目的。
3. 制备悬液
取10 mL 上述菌液，3500 r/min 离心10 min。弃上清液，菌体用生理盐水洗涤一次，再加10 mL 生理盐水制备菌悬液。
用NTG 作诱变剂，突变率大，进行营养缺陷型突变株筛选时，可以不经中间培养和淘汰野生型步骤。诱变处理后经生理盐水洗涤和稀释的菌悬液，可直接进行营养缺陷型捡出。
(三) 营养缺陷型检出
可通过影印培养法和逐个检出法检出缺陷型。本次实验用逐个检出法检测。
1. 涂布菌悬液
各取0.1 mL 菌悬液，涂布于完全培养基和补充培养基平板上，各涂布10 个平皿，30℃培养36~48h。在补充培养基上生长的大菌落为野生型，小菌落为缺陷型，挑出小菌落直接进行营养缺陷型鉴定。完全培养基平板上长出的菌落再用逐个检出法检出缺陷型。
2. 制备平板
制备完全培养基平板和基本培养基平板，在平板底面可沾上一张划有36 个方格的硬纸片(如图1所示)。
3. 接种
用灭菌牙签或灭菌大头针从完全培养基平板或补充培养基平板上逐个挑取菌落或小菌落，对应点接种在基本培养基平板和完全培养基平板上。注意应先点接种基本培养基平板，后点接种完全培养基平板，接种量应少些。30℃培养48 h，在完全培养基平板上生长，而在基本培养基平板的对应位置不长的菌落，可能是营养缺陷型菌株(图 2)。将其接种于完全培养基斜面，30℃培养24 h，作为营养缺陷型鉴定用菌株。
如用影印法检出缺陷型时，完全培养基平板上的菌落，最好控制在30~60 个/皿，用影印法分别接种于完全培养基平板和基本培养基平板上。
图2 逐个检出法接种示意图
[+]完全培养基； [-]基本培养基
