(三)溶液
1. 氨基酸混合液或无维生素酪素水解物
配制无机培养基时，添加氨基酸的浓度见附录。
2. 水溶性维生素混合液
配制无机培养基时，添加维生素的浓度见附录。
3. 碱基混合液或核酸(RNA)水解液
配制无机培养基时，添加碱基的浓度见附录。RNA 水解液制作方法见附录。
4. 部分氨基酸组合液
另取20 种氨基酸按表1 组合成9 组氨基酸混合液。1~5 组每组含4 种氨基酸，6~9 组每组含5 种氨基酸，添加至基本培养基后，使每种氨基酸同时在两组中出现，供营养缺陷型标记确认用。
表 1 氨基酸不同组合表
5. 青霉素溶液
10 000 u/mL。
6. 其他溶液
磷酸缓冲液(pH 6.0，0.2 mol/L)、生理盐水、硫代硫酸钠溶液（0.5 mol/L)、亚硝基胍溶液（0.5mg/mL)。
(四) 仪器
台式离心机、旋涡混合器、恒温培养箱、电炉等。
(五) 其他物品
无菌移液管、无菌试管、无菌离心管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、无菌玻璃涂棒、无菌牙签或插有大头针的无菌软木塞、稀释分离、平皿菌落计数所需的无菌生理盐水和无菌器皿等。
四、实验内容
(一) 诱变处理
1. 前培养
取新活化的棒杆菌T6-13 斜面菌种—环，接入盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养14~16 h，再取1mL 培养液转接于另一盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养4~6h，使细胞处于对数生长期。
2. 菌悬液制备
取10 mL 培养液于无菌离心管中，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，打匀管底菌团，加入5mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液，摇匀后倒入盛有45 mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中，振荡10 min，调整细胞浓度为5×108 个/mL，用完全培养基平板菌落计数法测定总菌数。
3. 诱变处理
(1) 称取0.5 mg NTG 于无菌离心管中，再加0.05mL 甲酰胺助溶，然后加入0.2 mol/LpH 6.0 磷酸缓冲液1mL，使完全溶解，用黑纸包好在30℃水浴中保温(临用时配制)。
NTG 是一种超诱变剂，需小心操作。称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁；取样需用橡皮头的移液管，绝不能直接用嘴吸，接触沾染有NTG 的称液管、离心管、锥形瓶等玻璃器皿，需浸泡于0. 5 mol/L 硫代硫酸钠溶液中，置通风处过夜，然后再用水充分冲洗；溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗；诱变处理后含NTG 的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH 溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。NTG 在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。
(2) 取4 mL 细胞悬浮液(5×108 个/mL 左右)加入上述离心管中，充分混匀，立即置30℃水浴振荡处理30 min(NTG 处理终浓度为100 ug/mL)后，离心收集菌体，将含NTG 的上清液倒入浓NaoH 溶液中弃去，用无菌水洗涤菌体3 次，以大量稀释法终止NTG 的诱变作用。最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水，摇匀后从中取出0.5 mL NTG 处理后的菌悬液，用4.5 mL 生理盐水稀释至10-3 稀释度。用倾注分离法在完全培养基平板上进行存活菌计数，每个稀释度做三个平皿，计算杀菌率。
4. 中间培养
将1 mL 诱变处理洗涤过的菌液，加入装有20 mL 完全培养基的250 ml 锥形瓶中，30℃振荡培养过夜(时间不宜太长，否则同一种突变株增殖过多)。
(二) 淘汰野生型(青霉素法)
1. 饥饿培养
取10 mL 中间培养液，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体3 次，加到无氮源的基本培养基中，30℃振荡培养4~6 h。
