一、目的要求
观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应
学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有快中子、₆₀Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。
紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成
胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和
可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料
(一) 菌种
枯草芽孢杆菌BF7658。
(二) 培养基(见附录)
肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基。
(三) 主要药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、碘液。
(四) 主要器皿
试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等。
四、实验内容
(一) 诱变
1. 菌悬液的制备
取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。
2. 平板制作
将淀粉琼脂培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。
3. 诱变处理
(1) 预热 正式照射前开启紫外灯预热10 min。
(2) 搅拌 取制备好的菌悬液4 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。
(3) 照射 然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1 min，2 min，3 min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。
4. 稀释涂平板
在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5 mL 进行不同程度的稀释。取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。
(二) 计篡存活率及致死率
1. 存活率
将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。

同样计算用紫外线处理1、2、3min 后的存活细胞数及致死率。

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