三、操作步骤
1、 噬菌体的分离
（1） 制备菌悬液 取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2） 增殖培养 于100ml 三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml，37℃培养12～24 小时。
（3） 制备裂解液 将以上混合培养液2500r/min 离心15 分钟。 将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵（如图2）。图上的真空表接或不接均可。
将离心上清夜倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内，37℃培养过夜，以作无菌检查。
（4）确证试验 经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在。
（a）于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
(b) 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，里 37℃ 培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。
2 、噬菌体的纯化
（1）如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1 毫升大肠杆菌悬液，使混合均匀。
( 2 ）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃ 水溶箱内备用）, 加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2 毫升，立即混匀。
( 3 ）并立即倒人底层培养基上，混匀。置37℃ 培养12 小时。
( 4 ）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃ 培养。
（5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。
（以上（1 ) ( 2 ) ( 3 ）三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量 ，最好在做无菌实验的同时，由教师先做顶备试脸，若平板上的噬菌体连成一片，则需减少接种量 （少于一环）或增加液体培养基的量 ；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做）。
