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从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-20

     
    附:如从2ml全血中提出取DNA,方法和步骤与从1ml全血一样,只是在步骤⑷ 纯化之前,把两个1ml全血的消化液管内容物合并后,加入220ul纯化液,上下翻转离心管几下后, 离心,速率为15000rpm, 1min, 把上清液吸出放入到装有1800ul无水乙醇的2ml管中,轻轻上下翻转10次, 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到200ul 70%乙醇中耒回漂洗20次,钩出DNA,在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4  C,过夜, 使之充分弥散后使用。提取完毕。
       如要立即用此DNA做PCR实验,把DNA弥散液放在58 C水浴中,保温30分钟, 用手指拍打离心管子,使DNA弥散后使用。提取完毕
       
    二.从200ul全血或体液中提取基因组DNA的操作步骤
    ⑴裂解1: 取200ul全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中,加入200ul的裂解液1。上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,离心速率为14000rpm,1 min.。倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次,这次也是加200ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。
    ⑵裂解2: 在上面离心管中加入200ul的裂解液2。上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min.。 倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入200ul裂解液2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。
    ⑶ 消化:吸取蛋白酶K 5ul ( = 0.1mg )加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打, 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后, 加入85ul消化液,上下翻转离心管, 务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58℃水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。
    ⑷ 纯化:在上面的消化液体中加入30ul纯化液, 上下翻转离心管几下后, 离心,速率为14000rpm, 1min, 把上清液吸出放入到装有240ul无水乙醇的1.5ml离心管中,轻轻上下翻转10次, 可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。
    ⑸ 收集:把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中, 滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上。
    ⑹ 吸取50ul 70%乙醇于滤柱内,离心800rpm,1min,弃去滤液。把滤柱放回收集管上,再离心 15000rpm ,1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。
    ⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取50ul 已温热到58 C的弥散液,轻轻放入滤膜的表面, 滤器在水浴58℃保温 10分钟。 离心 8000rpm ,1 min.,DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml 离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。
     
    附:从100ul全血或体液中提取基因组DNA
    ⑴裂解1: 取100ul全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中,加入100ul的裂解液1。上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,离心速率为14000rpm,1 min.。倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次,这次也是加100ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。
    ⑵裂解2: 在上面离心管中加入100ul的裂解液2。上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min.。 倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入100ul裂解液2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。
    ⑶ 消化:吸取蛋白酶K 5ul ( = 0.1mg )加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打, 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后, 加入60ul消化液,上下翻转离心管, 务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58℃水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。
    ⑷ 纯化:在上面的消化液体中加入20ul纯化液, 上下翻转离心管几下后, 离心,速率为14000rpm, 1min, 把上清液吸出放入到装有160ul无水乙醇的1.5ml离心管中,轻轻上下翻转10次, 可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。
    ⑸ 收集:把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中, 滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上。
    ⑹ 吸取50ul 70%乙醇于滤柱内,离心800rpm,1min,弃去滤液。把滤柱放回收集管上,再离心 15000rpm ,1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。
    ⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取50ul 已温热到58℃的弥散液,轻轻放入滤膜的表面, 滤器在水浴58℃保温 10分钟。 离心 8000rpm ,1 min.,DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml 离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。

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