【目的和要求】

1. 了解聚酰胺薄膜层析的基本原理。
2. 掌握聚酰胺薄膜层析的操作技术。

【实验原理】

聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。
聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和-NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。
物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。
无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。
【实验试剂和器材】
(一) 试剂
1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。
2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）
3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）
4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。
(二) 器材
聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器， 塑料手套等。
【实验方法】
(一) 薄膜的剪裁
取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2cm）。
(二) 点样
氨基酸的点样量以5ul为宜。点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。为加快样品干燥，可用吹风机吹干，注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸。
(三) 展层
在层析缸中放一个小培养皿，培养皿中倒入适量展层剂，将点好样品的薄膜斜立于培养皿中（注意点样的一端在下），展层剂的液面需低于点样线１厘米。当溶剂前沿距上边缘１厘米处时，取出膜片，立即用笔标出溶剂前沿的位置，自然干燥或用吹风机吹干。
（四）定性鉴定
用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均匀喷雾。晾干后，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf值。
在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf值），确定氨基酸混合样中氨基酸的种
类及位置。
【注意事项】
1. 选用合适、洁净的薄膜。勿用手直接接触薄膜。
2. 点样斑点不能太大（其直径应小于2mm）。吹风机温度不宜过高，否则斑点变黄。
3. 根据一定目的、要求，选择合适的溶剂系统。