6.2荧光显微镜检测
按照表1加样转染后48小时用荧光显微镜观察，我们在组合1和组合3中发现绿色荧光的CHO细胞，而在对照实验组合2、组合4和组合5中的细胞均无绿色荧光（见彩版I：图2～图6）。
6.3 FACS分析转染结果
我们依然按照表1中的转染组合使用24-well细胞培养板进行转染，每个组合平行做三组实验。转染后48小时将三组细胞用于FACS，分析50000个CHO细胞，计算绿色荧光细胞的百分比例，结果如图7所示。FACS分析表明：组合1中约0.08％的细胞具有绿色荧光，组合3中约0.15％的细胞具有绿色荧光，组合2、组合4和组合5中的细胞均无绿色荧光。
图7、各组合转染CHO细胞的FACS分析结果（平行三组实验）
7.讨论
短片段同源替换技术是近年来在同源重组的基础上发展起来的基因打靶技术。与传统的基于同源重组的基因打靶技术相比，短片段同源替换技术能够将打靶效率提高1000～10000倍。目前，只有少数实验室从事短片段同源替换技术的研究，并且研究对象仅仅局限于囊肿性纤维化和杜氏肌营养不良遗传疾病的细胞系和动物模型。我们试图将短片段同源替换技术应用于更加广泛的哺乳动物细胞系以及小鼠胚胎干细胞系。作为初步研究工作，选择打靶CHO细胞中游离的缺陷型EGFP基因的策略，使得极少数的CHO细胞在恢复绿色荧光表型后能够很容易在荧光显微镜下被观察到。由于这一策略的灵敏性，我们分别得到了0.08％和0.15％的经FG1和FG2小片段修复的细胞。
为了确认我们所引进的EGFP基因无义点突变（TAG）能够终止正常绿色荧光蛋白的表达，我们用携带缺陷型EGFP基因的质粒pEGFP(-)-C1瞬时转染CHO细胞，荧光显微镜观察没有发现绿色细胞。这就表明无义突变的引入成功地终止了绿色荧光蛋白的表达，因此实验中pEGFP(-)-C1分别和DNA片段FG1、FG2共转染CHO细胞后，荧光显微镜观察到的绿色细胞并非pEGFP(-)-C1渗漏表达的结果，而是DNA短片段同源替换引起的基因修正。
起初短片段同源替换的研究通常使用变性后的PCR产物，即ssDNA片段，后来的研究表明dsDNA片段具有ssDNA片段同样的效果，本文中我们使用的是dsDNA片段。在制备短片段DNA FG1、FG2 以及对照片断FA1和FA2的时候，我们为了防止PCR产物中存在的微量模板DNA可能对转染实验带来干扰，所用的片段均经电泳分离纯化后，再次PCR扩增和分离纯化（见正文“4.DNA小片段的制备”部分）。将上述片段分别瞬时转染CHO细胞后均没有发现绿色荧光蛋白的表达，说明上述片段均不能单独引起绿色荧光蛋白的表达。
另外，在按照表1的4个组合共转染CHO细胞后，我们仅在共转染FG1/pEGFP(-)-C1和FG2/pEGFP(-)-C1的细胞中发现有绿色荧光蛋白表达。而本实验室有人曾经将pEGFP(-)-C1与红色荧光蛋白（DsRed1）基因的DNA短片断共转染CHO细胞，没有观察到任何细胞恢复绿色荧光。这说明短片段同源替换介导的基因修复具有序列特异性。
FACS分析表明FG1和FG2修复缺陷型EGFP的细胞比例分别为0.08％和0.15％。由于并非所有的细胞都同时转入了片段和质粒，我们必须校正转染效率才能够换算出基因修复效率。我们共转染等量的pEGFP-C1和片段FR，估计质粒的转染效率约为10～20％。校正后的转染效率约为0.1％～1％，此结果与国际上其他研究组获得的结果相当。
短片段DNA的稳定性是本实验成功的关键之一。由于DNA片段没有进行任何修饰，进入细胞中的短片段DNA可能会被细胞中核酸酶降解而不能起到修复基因的作用。但是，参考本实验室其他研究人员的工作成果，在CHO细胞中单独转染短片段DNA 72小时后，仍然可以检测出完整存在的短片段；说明进入CHO细胞中的短片段DNA，降解较慢。我们考虑到脂质体的包裹可能对短片段的稳定性起到一定的作用，采用了脂质体转染的方法，而不是本实验室常用的磷酸钙共沉淀法或者电穿孔法。另外，短片段DNA之间稳定性的差异，可能是导致两种不同长度的DNA片段FG1和FG2打靶效率不同的原因。
人们对于短片段同源替换技术潜在的担心就是，进入细胞中的短片段DNA可能会随机整合进入细胞基因组DNA中。但是，从本实验室其他研究人员采取PCR检测的结果表明，DNA短片段没有随机整合入细胞基因组DNA中。
我们在CHO细胞中的初步研究结果表明，短片段同源替换技术在基因治疗和基因功能研究方面具有广阔的前景。本实验只研究了利用短片段同源替换技术对EGFP基因中的单碱基突变进行修正，今后我们将致力于在不同细胞中研究短片段同源替换技术对于多个碱基和同一靶基因中多个位点的修复能力。对利用短片段同源替换技术进行基因打靶而言，建立合适而有效的筛选机制以及提高打靶效率是该技术今后发展的关键问题。
致 谢
我要感谢李政道先生及其家人设立的“政基金”，为我们提供了一次在本科生接段参加科学研究的机会。同时我还要深深感谢我的指导老师薛友纺教授，感谢她一年多来对我的学习上的鼓励，工作上的悉心指导，生活上无微不至的关心和理解，以及在本论文修改过程中付出的极大心血。
感谢李成建师兄在这一年多时间里给予我的热情无私的帮助和指导。李师兄对于科学研究的热爱，以及对工作的一丝不苟、严谨务实，都给我竖立了良好的榜样。
感谢汤富酬、杨红波、赵文宁、时燕、张俊争以及宋臻涛在平时的学习、工作以及生活上给予我的关照。
感谢最亲爱的父母对我暑假研习工作的支持。整个假期我都没有回家看望二老，他们不但没有责备我，相反，经常地给以我鼓励和鞭策。
谨向所有关心和支持我的老师、家人和同学表示最诚挚的感谢！
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