3.pEGFP(-)-C1载体的鉴定
我们用LF2000（4 µg/each 24-well）将纯化后的pEGFP(-)-C1（2 µg/each 24-well）转染CHO细胞。转染48小时后，荧光显微镜下没有观察到绿色荧光细胞（见彩版：彩图1），表明了EGFP基因中的W58无义突变（W58→*58，TG G→TA G）能够有效地终止EGFP的表达。
4.DNA短片段的制备
分别以pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1为模板，使用引物1U和2D（5’-AGGGTGGTCACGAGGGTGGGCC-3’），进行高保真（Pfu DNA聚合酶）PCR反应，扩增双链DNA片段FG1及其对照片段FA1。FG1和FA1均为393 bp，处于EGFP基因的编码序列中。除第58位氨基酸残基密码子的中心碱基（FG1：TG G，FA1：TA G）外，FG1和FA1的其余序列均相同。
为了避免转染时模板的干扰，用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶纯化FG1和FA1（见图3），再分别以纯化后的FG1和FA1为模板，使用引物1U和2D，进行高保真PCR反应，大量制备FG1和FA1，并用Wizard® PCR Preps DNA Purification System（Promega）纯化，最终溶于无菌超纯水中。
同理，分别以pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1为模板，使用引物1U和1D（5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’），进行高保真PCR反应，以同样的方式可制备双链DNA片段FG2及其对照片段FA2，纯化（见图3）后最终亦溶于无菌超纯水中。FG2和FA2均为695 bp，处于EGFP基因的编码序列中，除第58位氨基酸残基密码子的中心碱基（FG1：TG G，FA1：TA G）外，FG2和FA2的其余序列均相同。
图3、分离PCR反应所得DNA短片段的电泳图

5.DNA短片段的鉴定
我们利用LF2000（4 µg/each 24-well）分别将纯化后的FG1、FA1、FG2、和FA2（2 µg/each 24-well）转染CHO细胞。转染48小时后，荧光显微镜观察，结果表明：单独转染DNA片段FG1、FA1、FG2和FA2的CHO细胞均无绿色荧光。
6. 靶向修复CHO细胞中游离的缺陷型EGPF基因
6.1共转染含有缺陷型EGPF基因的质粒及DNA短片段
我们按照表1，设计4个转染组合，各自使用24-well细胞培养板进行转染。转染后24小时，将每个孔中的细胞对应传至单个35-mm细胞培养皿中，相当于1：5传代。
表1、不同的小片段DNA与pEGFP(-)-C1组合共转染CHO细胞加样表

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