而SFHR作为一种利用基因打靶进行基因治疗的策略，它具有一系列优于上述传统的基因扩增的特点【1，2】：（1）进入的短片段DNA分子在体内进行直接的基因更正可以使基因保持在它原本的调控因子的控制下，不会影响细胞基因组的正常功能；（2）小分子的更正分子相对于质粒运载系统来说，可能增加向细胞以及细胞核转运的成功几率；（3）基因治疗一般用的是合成的小分子，不会引起免疫反应（Krieg AM等，2001）；（4）它不仅仅可以治疗隐形突变引起的基因病，还可以治疗显性突变引起的基因病；（5）基因替换具有比较高的效率（达1-10%），而表型的维持并不需要100%的更正，因而有效和永久性的基因修复可以用更少甚至一次治疗就达到目的。
SFHR的具体机理尚不清楚，但是它是源于同源重组发展起来的一项技术，似乎与同源重组有着相似的途径，例如应该都包括必要的基因校正，重组酶系统都引起媒介结构的生成，以及随后的单链插入和核苷酸的交换。但是具体的机理还有待澄清。
同源重组（Homologous Recombination）是指序列相似的DNA间交换遗传信息的过程。该技术已经被用于产生多种品系的转基因小鼠，提供了大量的遗传代谢疾病的模型（Műller U，1999）。然而，在体外实验利用同源重组修正遗传突变，效率非常低，仅10-5左右，并且通常伴有相等或者更多几率额外突变事件和非同源事件【5】。短片段同源替换技术能够在哺乳动物细胞中产生位点特异的基因转变，效率达到0.1～20％。并且短片段同源替换技术不仅仅局限于改变靶基因的单个碱基，它能够同时改变多个碱基以及同时在靶基因的多处位点产生基因转变。同时，它不但可以用于修正缺陷型基因，还可以在基因组引进突变，从而为基因功能的研究提供一个有力的工具。
目前，国际上对SFHR技术的研究尚处于实验阶段，但是已经取得一些成功的研究成果。例如：在人的上皮毛孔细胞（Human Epithelial Airway Cells）里，用SFHR对囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白基因（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene, CFTR ）缺失三个碱基的突变型F△508进行基因更正，效率可达到1％【3，6，7】,而且可以在表型上表现出来；另外，以小鼠杜氏肌肉营养不良型基因（Duchenne Muscular Dystrophy）的点突变为靶位点，培养细胞用SFHR更正，经PCR分析，效率高达15－20％【3，6，7，8】。
但是，目前国际上只有少数实验室从事短片段同源替换技术的研究，并且研究对象仅仅局限于囊肿性纤维化和杜氏肌营养不良遗传疾病的细胞系和动物模型。我们试图利用绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein Gene, EGFP）作为报告基因【10，12，14】在CHO细胞中进行短片段同源替换技术的初步研究，为在更加广泛的哺乳动物细胞以及小鼠胚胎干细胞中进行短片段同源替换技术研究奠定工作基础，并为研究基因功能和基因治疗提供新途径。我们采用靶向修复游离的缺陷型EGFP的策略，可以灵敏地检测到EGFP基因修复的绿色克隆。
首先，我们采用两步PCR的方法在EGFP基因中引入点突变，使绿色荧光蛋白的第58位色氨酸(W58,TGG)突变为琥珀型终止密码子（TAG）【11，13，15，16】，构建载体pEGFP(-)-C1。然后以pEGFP-C1为模板，通过高保真PCR分别扩增含有EGFP第58位色氨酸(W58,TGG)的双链DNA片段FG1（393 bp）和FG2（695 bp），同时；以pEGFP(-)-C1为模板，使用同样的引物通过高保真PCR分别扩增对照片段FA1（393 bp）和FA2（695 bp）。在24-well细胞培养板中使用阳离子脂质体Lipofectamine™2000（LF2000）分别将质粒pEGFP(-)-C1和DNA片段FG1、FG2、FA1或者FA2按照质量比1：5瞬时共转染CHO细胞。转染后用荧光显微镜观察，FG1、FG2与pEGFP(-)-C1共转染的细胞都有部分回复绿色荧光，表明FG1和FG2使CHO细胞中绿色荧光蛋白恢复了表达。进一步用FACS（Fluorescence Activated Cell Sorter）【16，17】分析确定了FG1和FG2介导基因转变效率,证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因.
2.pEGFP(-)-C1载体的构建
我们以质粒pEGFP-C1(Clontech)为模板，采用两步PCR定点突变方法，将EGFP基因编码序列中第58号色氨酸残基（W58）的密码子TGG突变为终止密码TAG（*），构建载体pEGFP(-)-C1。
首先,用引物1U(5’-CACGGGGATTTCCAAGTC-3’)和引物6D（5’-ACGAGGGTGGGCTAGGGCACGGGCA-3’）， PCR扩增出384 bp的上游片段P1；用引物6U（5’-TGCCCGTGCCCTAGCCCACCCTCGT-3’）和9D（5’-CCTCTACAAATGTGGTATGGC-3’）PCR扩增出672 bp的下游片段P2，P1和P2中都含有引入的点突变（TG G→TA G）。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离P1和P2，并切胶回收纯化（Wizard® PCR Preps DNA Purification System, Promega）。取P1和P2大约各10 ng，混匀后作为模板，用引物1U和9D扩增出1031 bp的包含有W58无义突变突变的EGFP-基因片段P3，P3的两端分别含有限制酶切位点Nhe I和Hind III。上述PCR反应皆使用高保真Pfu DNA聚合酶进行。
然后，取10 µg pEGFP-C1和5 µg片段P3分别进行Nhe I和Hind III双酶切。0.8%琼脂糖凝胶电泳分离pEGFP-C1和片段P3的酶切产物，分别回收3970 bp的pEGFP-C1酶切片段和761bp的P3酶切片段。调节两者比例约为1：3，用DNA Ligation Solution I（DNA Ligation Kit Ver. 2, TaKaRa）进行连接反应，获得载体pEGFP(-)-C1。
