也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系．
62)急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！
不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话．
63)我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？
是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．
64)比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.
65)请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝
你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.
我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀.。此外，有人建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选择的柱子有哪些？谢谢。
那你没有说明G200的峰是不是有活性，你也可以考虑硅胶填料，那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以做HPLC，这样也是不错的选择，毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果。
66)如果我用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液？因为我认为，如果选择含盐的缓冲液，本身带入了盐，能起到脱盐的效果吗？如果选择含盐的缓冲液，
缓冲液里含有的盐会最后流出来吗？
另外，分子筛有没有载量的问题？
缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.
分子筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系.
67)既然这样，我想完全脱盐时，洗脱液可以选择水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对不对？
是的,只要你的样品在水中溶解得很好,而且很稳定,那选择水就可以.
68)请教色谱兄，我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page检测了一下，没有完全分开，有一些是一起流出来的，我想知道为什么分离效果不好？我该如何调整阿？加长柱子可行吗？还是要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！
peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.
69)非常感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好很多吗？另外，上次你给我了份材料没有价格，能否给份有价格的材料，这样也好和老板谈谈，因为老板控制的挺严，谢谢！！flyhyx@yahoo.com
有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。
70)想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。
亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。
