1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.
2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题.
4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.
1,那你按我提议试试吧,降低缓冲液浓度,提高pH值.
2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似.
3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟.
47)你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差？
48)有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.
我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
49)问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
50)多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差?
理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。
51)我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
我分别用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的顶多只有２０IU／５０ｕｌ。
所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液，发现酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后来的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我还想请教您：
阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否推荐一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不能分装，需要避光保存，先谢谢了！
那用更高点的盐洗脱看看，例如2M，如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是没有挂住呢。
保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳汞。
