38)一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
39) 我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40)谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP－Sepharose 4B纯化，以后你多留意点，
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
41)我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶？GOOGLE 搜不到。我们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。
42)查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography 有没有人做过的，有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.
43)请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！
那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮，避免局部浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。
44)三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。
1。TFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。
具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁对！ ^_^
45)我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?
2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?
谢谢你的指导!!
