33)楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34)我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.
35)楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
36)我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在E Coli中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST 胶。开始时采用先洗脱融合蛋白，再酶切，洗脱采用10mM GSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋白的结构的。不过人家的蛋白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding 效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。
2、过去曾做过superdex200 10/300分离酶切产物时，由于目的蛋白聚集，我也没有marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？
3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存在，如果加入50% TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！
4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流速改观也不明显，后来结合的时候binding buffer中也加表面活性剂稍微好一点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型表面活性剂，binding时在加入triton X-100，采用混合表面活性剂，据说可以使GST部分复性，增加binding，我还没有试过。
您有这方面的经验么？多谢了
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以建议你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
37)色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
