165)chromatography,你好。我现在遇到一个非常头痛的事情，最近用分子筛SephadexG100来分离虾的总蛋白的时候可以把大分子和小分子蛋白分开，可是条件不变，换了蟹的材料就不行了，而且提高盐的浓度或PH值都没有使分离效果得到改善。请帮忙分析一下。分离条件如下：柱体积为80ml，流速为0.1ml/min，上样方式手工上样，缓冲液：0.05M磷酸缓冲液，PH=6.4。分离图谱和SDS电泳结果见附件。请问如果换一种孔径的分子筛是否能够使蟹总蛋白分离效果改善？如果是应该换大的还是小孔径的？您还有其他好的建议吗？谢谢了！
要把大蛋白和小蛋白分开,那你干脆选择范围更小点的填料,例如G-50也许更好点,此外对凝胶过滤改变pH和盐对分离效果没有什么影响.你的流速也太慢了,可以提高到0.5ml/min左右.抱歉忽略了,以为已经回复过了呢.
166)还有一个问题想问一下。纯化的酶最终要冻干成制剂，静脉注射。可是内毒素很难合格，好不容易成功过几次，现在又不行了。而且我用的TRITON X－114萃取分离不适合放大。该酶理论等电点8.4。ph稳定范围7－11。肯定不能用阳离子柱了。内毒素合格标准每mg小于25EU。请问可以用什么方法，或者什么填料？哪可以提供少量填料小试一下（我们公司只有看到可行才会买大量柱料）？
据我所知，内毒素的控制可以采取一下措施：
1 首先所用的容器必须经过干烤，180摄氏度4小时以上，使粘附在容器上的内毒素分解。
2 配制缓冲液的盐类必须保持不被内毒素污染。所用蒸馏水应该新鲜配制，所用试剂也最好新鲜配制，因为缓冲液在常温下很容易孳生细菌，而是溶液产生大量的内毒素。
3 配制好的液体用0.22微米的滤器虑过。
这样处理的话，有师兄将内毒素控制在了0.5EU/mg蛋白，符合FDA 的规定。
不妨一试。
你的酶是不是有同工酶,这酶有什么特点,需要辅酶吗,不知道有没有试过疏水,此外也可以用染料亲和的方法,不知道有没有可能用亲和的办法.
萃取的方法回收率要低,而且如果临床那也得对你的的TRITON残留也是个问题,不好去干净.我们有专门去除内毒素的填料,可以给你点小样,你可以PM你的邮件给我,我把我们的材料发给你.我们是用亲和的方法,特异去除内毒素,收率高.你可以试试.
167)我在纯化一个天然蛋白，纯化出来后没有抗原活性，请教原因。
流程是这样：提取－－－－conA柱－－－－－DEAE柱（梯度洗脱）
－－－－ －总蛋白 －－－未结合部分 －－－一个蛋白
－与抗体 －－反应 －－－－反应－－－－－－－ 不反应
很是苦恼，最近才发现这个宝地，请不吝赐教。
会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.
首先谢谢你的答复。第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白，然后在上的交换柱，文献上基本上都这样，而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白。不过我将试试直接上离子柱的效果。
电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外，几乎没有什么蛋白出来。离子交换柱不就是这种性质吗？我一直这样认为，蛋白挂在柱上，经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白，没用的蛋白就洗不下来。不知对不对。
conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢.
168)在层析过程中，我只是少量蛋白纯化，并且基本上是在4度层析柜中进行的，没有脱气，结果装柱装了几次，还是有一些气泡（开始在室温中装的，装好后放到层析柜中），由于样品已经处理好，最后一次有一些气泡我也没办法，我只能上样，结果在再平衡过程中出现很多峰，花了几个小时，还是没平衡，时不时又出现一个峰，真的很郁闷，这时我再看柱中的气泡时，几乎气泡都消失了，原来气泡一般都在柱壁上，是不是气泡跑到柱中间填料里去了？出现这么多峰，其它的问题都不存在，是不是气泡的缘故？如果装柱过程中有气泡，层析过程中会出现哪些情况？谢谢！
造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差, 这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡, 你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你说的问题说明的确是有气泡，气泡不是进入填料中间，而是出去了，或者变更小了，一直出到检测池中，所以一直有小峰上去又很快下来，装柱子装好后再放到层析柜中也不会有气泡的，主要还是有温差造成的，如果柱子中有气泡有两种情况，一是气泡一直不断，有气泡也赶不走，二是可以把气泡赶走，但是越多越难赶，因此最好是没有气泡，否则柱子分离效果也不好。
你说的情况似乎跟我的不一样，我装柱的时候，液体都放在层析柜里，并且恒流泵也放在层析柜中，柱中都是刚从层析柜中拿出来的,还有，我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来，慢慢上去，下得也很慢，持续的时间相当长，不知为什么？很急，做得很烦，是不是填料有问题？
气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.
169)我这几天作DEAE sephadex 50离子交换，上样前检测有蛋白，但是洗脱梯度0.1mol/L到1mol/L。但是检测没有任何蛋白（280nm），实用的缓冲液tirs－Hcl 8.0
样品是碱性蛋白酶。不知道什么原因？谢谢！！
那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来.
170)我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的，洗脱条件都已经摸索好，最近我觉得我们CM填料有问题，我们还有SP填料，我想请问一下，如果我用SP填料的话，用CM填料的洗脱条件是否适用？能否得到相同的结果？
还有一个小问题：
使用分子筛时，每一种填料都有一个分级范围，我想请问一下，洗脱体积跟洗下来的蛋白的分子量之间的具体关系是怎样的？就是说，比如Sephadex G-25 的分级范围在1000～5000，多少柱床体积，分子量1000的蛋白分子就出来了？一般洗几个柱床体积就可以了？谢谢！
1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.
2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.
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