哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.

158)请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗？或用1M醋酸钠 pH3.0？
还有它们的上样浓度一般在什么范围内？有没有什么要求？

应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.
上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在>20mg/ml左右,太高我没有上过.
 
159)我现在想用蛋白来亲和纯化我的抗体
蛋白SDS-PAGE就有一条带，但western效果很差
所以我想进一步纯化一下蛋白，来亲和纯化抗体
现在我想电洗脱来纯化一下蛋白
但对用考染后的蛋白是不是可以用于亲和柱来纯化抗体呢
具体应注意什么问题呢

变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道位置后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.

160)请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his tag 融合蛋白,杂带忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.

我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非特异吸附.

161)你好版主！我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析？另外separose 4FF分离2万左右分子量的蛋白效果会如何？如果改成 6FF应该怎样换介质？

8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能保证硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性分子,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用.

162)请问chromatography 师兄, 纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?

低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用离,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.

163)偶纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白，超声裂菌后40％硫酸铵沉淀，然后DEAE Sepharose FF纯化下来纯度85%左右，有3条杂带，分别为130KD+、～55KD、～45KD，目标蛋白分子量为74KD，偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化，可是偶的这个蛋白比较奇怪2M NaCl才能挂柱，（用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了），可是挂上之后0M NaCl也洗不下来，而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来，是不是偶的疏水做的有问题呀？还有一个问题就是国产的柱子和仪器哪家的比较好？我现在用的柱子没有接头，对拉梯度会不会有很大影响？

其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,应该和你操作没有关系.
国产的机器和柱子上海就有,上海沪西的就不错,柱子一般用锦华的.如果你的柱子没有死体积就没有关系.
后面的操作没有问题,一点坑没有关系

我之所以不先用疏水是因为疏水的分离效果很差，下来后还有好多杂蛋白，不如DEAE效果好，我现在用DEAE纯度可以达到85%，但是下一步不知道选什么介质好了，疏水不是很理想，我刚才用2M NaCl上样，用500mM NaCl到0M NaCl 50%乙二醇的梯度洗脱，结果都洗不下来像样的峰，是一个扁扁的A280最高值才7，偶用的柱子是1X17cm,流速0.9ml/min，洗脱体积>10CV.还有不知道Butyl、OCtyl和phenyl差别大不大，如果换他们两个会不会有不同效果？还有偶的蛋白是个多聚体，凝胶过滤好像没甚么戏。不知道您还有什么推荐的介质供选择吗？偶的蛋白不怕变性。

是吗,那会不会你的蛋白再盐情况下容易沉淀,所以没有没有得到象样的峰呢,如果是这样你可以降低浓度,调pH看看,我怀疑是沉淀到柱子上,或者你用盐酸胍洗看看,通过调pH可以改变溶解度,此外可以用凝胶过滤做试试,或者尝试燃料亲和或金属螯合试试,也可以用羟基磷灰石做试试
164)chromatography :您好，我想请教一个问题，我要把标记碘的900KB的蛋白与游离碘分开，用凝胶层析法，应该用多长的柱子及多大型号的凝胶呢？

游离的碘是溶解状态的吗，这个我不清楚，如果是小分子的，那可以透析或者sephadex G-25柱子就可以，你试试吧，不知道你处理多少体积，一般上样量是柱子体积的1/5或1/4

游离的碘是溶解状态，我用过sephadex G-200，分离效果很差，昨天刚用过sephadex G-25，效果也不好，第一个峰下降的不快，并且两个峰之间的值仍然很大，远远大于本底值，我用的柱床体积是18立方厘米，每次上样量只有100微升。您看我哪个地方需要改进？谢谢！

你上样可以上到3-4毫升试试,上样太少扩散厉害,如果你做了还不行,那你可以透析试试吧.

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