7)利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
8)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达
你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）
至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。
9)我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢
对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。
环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。
10)我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000， 等电点4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）
你用过分子筛吗？superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。
如果问题请与我联系。myhok@sina.com，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg
11)请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？
复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.
12)我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和洗脱缓冲液好？
我现在拟的是：
可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响
13)这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗脱采用的离子强度的大小范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的离子强度
一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高的盐浓度。
当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错，虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，而且能很精确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法
14)你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。
我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。
目前检测protein aggregation的方法主要有四种。
1.gel filtration. 根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。
2.native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。
3.Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。
4.超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。
