只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧.

152)你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达到80%以上. 现在的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% .

我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.

153)我想问一下Ｃ８柱用于分离蛋白质或肽类物质时，怎样选择洗脱的试剂？我对ＨＰＬＣ不懂，但现在需要用！谢谢！

你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.

154)今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：IPTG0.1mM，26～29度3小时。细菌离心后用PBS重悬，-80度反复冻融3次，蛋白酶抑制剂只加了PMSF，超声（可能有点过，有部分泡沫），加tritonX100后RT摇20min，添加DTT至10mM（操作手册说可以增加跟柱的结合）后10000g离心，上清过柱按说明操作。SDS-PAGE的结果，沉淀仍然有大量目的条带，过柱前的上清的同一位置就只有很淡条带，过柱后相类似，PBS洗出液里蛋白就较稀少，但关键洗脱液中就只见约26kD的条带，怀疑GST，但从何而来？
我曾经按此步骤纯化过分子量比较小的一个蛋白（含GST约55kD），纯化得率还可以，但这次失败的原因是什么呢？

我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧.

谢谢chromatography的教导，现在我已经决定不切除GST，凝血酶也很贵，不成功，则成＃％￥，所以，应该GST对研究影响不大吧。
是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢？我添加的DTT是不是也有影响？怎样超声不会太过？我500ml菌液浓缩到15mlPBS，超声几次都还很粘稠，请再给予指点。
变性剂是指哪些？
此外，听您讲有国产的层析柱还是怎样，可否给小弟一些资料？

我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍

155)我的酶蛋白单体分子量约为90KD，其四聚体的分子量约为360。
我现在用的凝胶柱是S-200，是不是不大合适？此外，做SDS-PAGE时，有一条杂蛋白，和我的目标蛋白距离很近，一直分不开。不知道该怎么办？

你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧

156)我在做一个核内定位的蛋白，预测等电点是10，60KD。做过好久的亲和纯化，有N端his-tag，C端his-tag, 还有N端GST-tag的，纯化时的问题都一样：包涵体表达为主，上清含量很少。用低离子强度的PBS破菌的化，上清中含量会多一些，但是蛋白不挂亲和柱。洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分，用透析，PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀。上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏水柱也不挂，也试过阴、阳离子柱，还是不挂柱。因为蛋白活性未知，所以我不倾向于做包涵体纯化，但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白，都没能拿到比较纯的包涵体，而且在包涵体中his－tag耦连的该蛋白也不挂柱，很迷惑，在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧？
既然是包涵体本身应该有一定的纯度，不挂柱，那你用的是哪家的产品呢，此外怎么操作呢，你能说详细点吗，有的时候也许结合力比较弱，所以要选择镍密度高的填料，延长作用时间，提高pH值，降低流速，一般天然结构不挂的时候有，但是变性不挂很难理解，此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱，原因挺多的，所以需要你说详细点。

我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA agrose，应该不是镍柱质量问题，用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想，至于是不是有其他物质干扰我也不能确定，但是我试过这么多载体和tag，效果都一样，就觉得是蛋白本身性质的问题了

据说在靠近等电点附近的ph条件下，8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的，不知是不是有这个情况，但是据预测的数据来看，好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的

至于操作呢，亲和纯化我们用的都是agrose，在离心管里agrose与菌体上清4
度或者室温结合2hr～过夜不等，结合条件应该是很充分的了，很迷惑

另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话，用哪种型号的分子筛来做HPLC合适呢？

做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我建议你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.

如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.
此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.

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