也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子上,所以洗不下来.

我的蛋白的确很不稳定，但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外，我是用SKL溶解包涵体后透析除SKL复性，用非变性PAGE检验过的，如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗？
我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用SKL处理，丙酮沉淀后SDS－PAGE发现目的蛋白就在里面，真郁闷呢……

所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.

125)用离子交换分离蛋白质或多糖以往多用弱的离子交换树脂，现在出现了许多强离子交换树脂，如Q Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow，资料上介绍这些埴料性能较好。请问楼主，是否我买了Q Sepharose Fast Flow一般就不用买DEAE Sepharose等弱阴离子填料？谢谢。

我觉得Q可以部分代替DEAE.

126)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达

你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试.

至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。

请问什么是分级沉淀包涵体？

参考这个帖子吧:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=961391&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#961391

127)我的蛋白是水溶性蛋白，还有整个操作过程所用的缓冲液都一样。根据氨基酸来看等电点大概4，我的缓冲液PH为8。包涵体溶解液大概10ml吧，稀释成100ml透析去除SKL，然后PEG20000浓缩回10ml，取一半上Sephadex G－100，峰形很漂亮，SDS－PAGE检测去除了部分杂蛋白，收集峰再用PEG20000浓缩成5ml，上DEAE－Sephadex A－50，上样后可以看到柱顶部挂着蛋白，但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白，后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M，还是不行。
那你就把缓冲液pH调到6-7,然后再做纯化试试.我还是觉得因为沉淀所以洗不下来.
 
128)我是搞药剂的，想请教一个问题，我将分子量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm（粒径范围50-400nm，材料为单硬脂酸甘油酯，分子量358.6，采用药剂学方法聚合成载药纳米粒，聚合后分子量我也不知道，只知道粒径）的纳米粒中，现想将游离药物和载药纳米粒分离，请问应该选用何种规格型号的Sephadex填料？文献有用Sephadex-G50的，我有Sephadex-G15，不知可否？谢谢！

我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子上面或中间,G50也也这些危险,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适.
 
129)蛋白质去盐究竟是过柱好还是透析好？是否与柱子的质量有关系呢？

都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快.

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