116)以前请教过你的一个问题想再请你帮忙：
我做的是原核表达GST-融合蛋白，分子量46.9KD，通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，可溶，正在做纯化，但是过柱纯化后有杂带，现在我按你的建议多洗了几个床体积，杂带少了，但还是有，我用的是Glutathione Sepharose 4B的柱子，pharmacia公司的，就是那种小的已经做好的一次性的小柱子，它不用我调整流速和作用时间，填料也不用我自己弄的。
请问：
1.这种柱子有什么缺点吗？
2.我要蛋白的目的是免疫兔子取抗体，多抗和单抗各需要的蛋白量约多少，纯度要很高吗？
3.如果纯化不理想，能否多次SDS-PAGE电泳后切胶直接免疫？

1.柱子没有什么缺点，硬找的话，那也只是上样量小点，流速慢些，我们也生产这样的柱子，很好用，节省不少时间。
2，蛋白的量估计有10mg就可够了，你可以问免疫版的看对不对。
3可以直接切胶，纯度在95%左右就可以了。

117)我是学分子生物的，最近我们要用噬菌体展示技术找一个膜蛋白分子交互作用蛋白，因为噬菌体展示技术最基本、最关键的一步就是要纯化蛋白，但是完整膜蛋白纯化好象比较困难，而且表达的蛋白质形成了包涵体，另外它有三个二硫键，纯化过程中破坏包涵体的同时，可能又很难保证蛋白的活性，不知你有没有好的方法或经验可以告知。谢谢
这个我就不清楚了,膜蛋白本身就不好溶解,需要用表面活性剂,如果是包涵体那需要复性,有三个二硫键,你可以参考有二硫键包涵体复性的方法去做.

118)我是搞活性多糖及糖蛋白研究的，分离纯化方面是新手，我打算订一些填料（分子筛和离子交换）用来制备多糖和糖蛋白，由于填料种类太多，不知我该如何选择？请楼主推荐几种常用的填料组合，谢谢！

糖蛋白的纯化其实可以充分利用它们的特点可以用疏水,亲和(凝集素,硼酸类)这些方法去纯化,离子交换和凝胶过滤填料的选择得按你的分子量和等电点,你没有太具体的差数很难说,因为的确品种比较多.

119)我想从蛋白粗提物中分离的40KD以下的蛋白质做进一步的实验，蛋白质的具体性质不知道，应该选用什么样的分离纯化方法呢。谢谢。
那你看有没有截留分子量在50KD以上的膜,超滤到你要的的蛋白,,这样进一步用离子交换或者凝胶过滤去纯化,如果你的蛋白有一些特殊性质也可以用亲和或者疏水.

120)请教chromatography兄，我用Amersham 的Hitrap chelating 1ml 小柱来纯化带His-tag的蛋白，自己感觉洗脱峰还是蛮漂亮的，但是洗脱物跑出来的电泳很模糊，请问是什么原因啊？
色谱图漂亮也不一定电泳图就漂亮,模糊是不是你的蛋白浓度太低,有没有盐呢,如果是这样的话,那电泳图不会好看的,你把样品透析浓缩,再跑电泳看看.

121)楼主请问一下在做疏水层析的一些问题.
1.疏水的blinding buffer中一般要加那些试剂.
2.离子对试剂常用的有那些,在做疏水层析时是否应加这些试剂.
3.一般根据怎样的规则来选这些试剂和疏水填料
还有离子排组色谱的填料有那些呀,他的分离的机制又是怎样呢?

1.疏水通常情况下不需要添加什么物质,就是高浓度的硫酸铵,氯化钠等盐,离子对是适合做反相用,蛋白纯化中不加这些物质.常用的我就知道三氟乙酸别我也不清楚.
2.疏水的填料我们选择一般就用苯基的,别的不怎么用,一般用苯基足够了,实在不行再换别的.
3好象没有离子排组色谱,应该是凝胶过滤色谱吧,分离原理很简单,那就是因为凝胶是多孔的,所以小分子能进入更小的孔,而大分子进不去,因此小分子流经的路径大于大分子的,选择的填料最常用的也就是葡聚糖凝胶,葡聚糖混合琼脂糖凝胶,还有烯丙基接枝葡聚糖凝胶,代表的产品有sephadex系列,superdex系列,sephacryl系列,具体的填料结构和规格可以参考<生物工程下游技术>

122)我纯化的蛋白等电点预测为8.04左右,我用ph6.5的１０mM磷酸钠，１mM　ＥＤＴＡ的缓冲液，柱的填料为ＣＭ－钎维素，上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白，不幸的是目的蛋白也被洗了下来，接下来的梯度洗脱根本就无用．请帮我看看是哪儿除了问提！

把缓冲液pH调低点，到5左右，样品要的盐浓度和pH都不能高于你平衡缓冲液的浓度。
 
123)请问sephadex G-25和QAE-sephadex A-25使用,再生的方法.
我要分离分子量700左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)

都可以用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用50%乙醇洗,然后保存在20%的乙醇中.
700左右的物质是什么东西,也许只能用RP-HPLC了.

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