那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.
2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。
3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。

97)我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了，
1.为什么目的条带不见了？
2、下一步应该怎么办呢？
如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是
triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。
此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。
 
98)手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉
最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0
我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱
蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错的效果。
填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。
 
99)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。

100)用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？
一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了

101)有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。
我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。

HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。
102)请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！
已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。
是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度.

104)chromatography兄:
非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。
目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？
另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.
至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:
http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins

105)我想用DEAE纤维素来做填料
我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？

DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢.

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