71)我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：
1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。
2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。
有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。
我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。
72)1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？
那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.
ACN 中含有1％的TFE。
有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净
column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。
我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该没有问题.方法也没有错.
73)想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。
这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.
74)请问聚乙二醇的检测波长是多少？
聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.
75)怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？
你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.
76)那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？
maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.
77)我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？
我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.
78)你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。
那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.
79)有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？
国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
