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动物肝脏中DNA的制备
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-12

    二、实验材料、试剂和仪器:
    (一)材料:动物肝脏
    (二)试剂:
    (1)0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液:
    (2)20%SDS溶液:
    (3)氯仿一异戊醇(24:1)混合液:
    (4)95%乙醇溶液。
    (5)80%乙醇溶液。
    (三)仪器(略)

    三、实验步骤:
    •1.取新鲜动物肝,除去结缔组织,用0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗去血液。在冰浴中切成小块,称取10g,加入两倍体积0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液,于研钵中研磨至匀浆,以3000r/min的转速离心10min。
    •2.在上述沉淀物中加入0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液,使总体积为20mL,然后在60℃下,滴加20%SDS溶液1mL,边加边搅拌,再摇动10min,使核酸与蛋白质分离。
    •3. 边搅拌边加固体氯化钠2g,使其最终浓度达到l.4mol/L,再摇10min。
    •4.加等体积的氯仿一异戊醇,轻混,静置,离心管内的物质分为三层,上层为含DNA的水相层,下层为氯仿一异成醇混合物,中间层为变性蛋白凝胶。吸出上清液,倒入另一离心管。
    •5.加1/2体积的氯仿一异戊醇混合液,振摇20min,以3000r/min的转速离心10min。
    •6.吸出上清液,加入2倍体积95%乙醇溶液(预冷),产生沉淀。
    ·①用玻棒搅拌,DNA的丝状物即缠在玻棒上,用80%乙醇溶液洗涤一次。
    ·②再以4000r/min的转速离心溶液10min,弃去上清液,沉淀用80%乙醇溶液再离心洗涤一次。
    •7.将沉淀置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥后,加入1ml 蒸馏水,使DNA充分溶解,待用。
    核酸提取过程中的注意事项:
    (1)避免过酸过碱或高温环境,合适的T:0-4℃,
    pH4-9;
    (2)防止机械力的切割作用,避免剧烈振荡;
    (3)防止核酸酶的降解作用,可加入抑制剂-EDTA,柠檬酸钠;
    (4)整个操作步骤应尽量简化,缩短实验过程,减少核酸变性、降解、机械切割的机会。

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