2结构组成
酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。
此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
(三) 酵母双杂交系统局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力， 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统viii也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感性趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用， 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段
二、反向酵母双杂交系统
确定了蛋白之间的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、结构及其作用的条件调节。鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的抑制作用， 不仅有助于探索相互作用的结构单位， 而且可作为研究体内功能的遗传学方法。这对于多个作用分子的蛋白就更为重要。
1996年Vidalix x等建立了反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)， 提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。反向酵母双杂交系统的关键是掺入一种表达产物对细胞生长有毒的报导基因， 用于监测蛋白间的相互作用。例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的， 同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。Vidal等构建了一酵母细胞株， 其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。
反向双杂交系统可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构和功能的关系。此外此系统还可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。
