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植物基因组DNA的分离
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-12

    核酸的分离与提取是分子生物学研究中很主要的基本技术,样品质量将直接关系到实验的成败。但是,不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。目前,国际上已有许多DNA的提取方法,有较为通用的(Bendich等1980,Dellaporta等1983,Metter 1987,Murray和Thompson 1980,Rogers和Bendich 1988,Taylor和Powell 1982),有专门针对含较高多糖、多酚等次生代谢物植物的(Baker等 1990,Webb和knapp 1990,Couch和Fritz 1990,Guillemaut和Mare chal-Drouard 1992),有针对具体物种的,如棉花(Callahan和Mchta 1991)、甘薯(Baradarjan和Prakash 1991)、莲属植物(Kanazawa和Tsutsumi 1992)等。 
     
    (2)所得DNA应当完整,电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型。
    (3)所得的DNA应有足够的量。例如,要研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况,也许就要求从单株植物中提取的DNA可作100次分析;而在从大量植株中筛选一个单一遗传标记时,只需在一个Eppendorf管中微量提取得到的DNA就绰绰有余了。
    如果是对植物进行大规模筛选,还应当满足下面这项要求:操作程序应当快速、简便、价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。
    有关植物DNA提取步骤的原理,本节将从众多的DNA提取方法中,结合本实验室的体会,选择CTAB法作一简介。CTAB(cetyltriethy lammonium bromide)是一种去污剂,这种方法的原理是:一定浓度的CTAB与核酸结合并通过离心形成CTAB-核酸复合物沉淀,而多糖等留在上相中。要使CTAB-核酸复合物的分开则先溶于高盐溶液中,再用乙醇沉淀核酸,CTAB溶于乙醇中。所得核酸DNA大小为20~50kb。很少有RNA干扰,必要时也可用RNase去除残留RNA。无论是新鲜材料或经脱水处理的材料,本方法均适用。
    1.1 试验条件
    【药品试剂】
    抽提缓冲液(2×):
    CTAB(W/V)                    2%
    Tris-HCl(pH8.0)                     100 mmol/L
    EDTA                                 20 mmol/L
    NaCl                                   1.4 mol/L
    巯基乙醇                                   2%
    10%CTAB溶液:
    NaCl                                   0.7 mol/L
    CTAB                                 10%
    沉淀缓冲液:
    CTAB                                 1%
    Tris-HCl(pH8.0)                     50 mmol/L
    EDTA                                 10 mmol/L
    巯基乙醇                                   1%
    CsCl梯度溶液(每梯度):
    CsCl                                          25 g
    TE缓冲液(pH8.0)           25 ml
    溴化乙锭(EB)                 5 mg/ml
    TE缓冲液:
    Tris-HCl(pH8.0)                     10 mmol/L
    EDTA                                 1 mmol/L
    异丙醇溶液:向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现,然后边搅拌边加入固体CsCl,至下层TE相中出现白色沉淀,两相混匀待用
    液氮
    氯仿/异戊醇(24/1)
    异丙醇
    2%巯基乙醇

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