引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。
5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。
现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。
如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物的保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别
特异性：避免非特异性扩增
扩增区域的二级结构
模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。
扩增区域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol
引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃
Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) - 500/length
引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2O VH2O (单位：L)
退火温度
最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25
一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
引物设计软件
Primer Premier 5.0
生物软件网下载
安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo
primer 3
The Primer Generator
NetPrimer
如何使用Primer Premier 5.0
引物设计
一般引物设计
5’带酶切位点引物设计
巢式PCR引物设计
多重PCR引物设计
探针设计
引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物
选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物
选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物
