1. 2 方法
1. 2. 1 淋菌培养及药敏 淋菌通过培养、革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验确定;用琼脂稀释法进行青霉素及四环素药敏试验,测定MIC。
1. 2. 2 DNA 模板的提取制备 将分泌物接种于淋菌培养基上,放CO2 孵箱37 ℃培养24～48 h ,取2～3 个菌落于50μl 蒸馏水中,100 ℃15 min 加热裂解,13 000 r/ min低温离心15 min ,取上清液备用。
1.2. 3 PCR 扩增 在微量离心管中依次加入10 ×PCR缓冲液3μl (含MgCl2 1. 5 mmol/ L) ,引物各10 pmol , 10 mM dNTP 0. 25 μl , Taq DNA 聚合酶1. 5 U ,模板DNA 2 μl ,蒸馏水至30 μl ,反应条件,94 ℃预变性2 min ,再94 ℃30 s ,50 ℃60 s ,72 ℃60 s ,35个循环后,72 ℃延伸5 min。
1. 2. 4 扩增产物的检测 将扩增产物点样于2 %琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0. 5 mg/ L) , 100 V 电泳20 min后,紫外透射仪观察结果并进行凝胶照像。
2 结 果
2. 1 淋菌分离株PCR 扩增结果 经淋菌培养鉴定的阳性菌株20 例, 进行PCR 扩增后, 在150 bp(20/ 20 ,CPPB 扩增产物) 、224 bp (10/ 20 ,TeM21 扩增产物) 、316 bp (8/ 20 ,Tet2M 扩增产物) 各有一条带出现,结果见图1。
图1 淋菌标准株、分离株PCR 电泳结果
注:1 阴性对照,2、3 淋菌阳性菌株,4、5 淋菌阳性同时耐青霉素菌株,6、7、8 淋菌阳性既耐青霉素又耐四环素菌株,9 标志物:分子量为150 bp 、224 bp 、316 bp ,10、11、12 淋菌标准菌株A、B、C。
2. 2 淋菌标准菌株及其他细菌扩增结果 分别将淋菌标准菌株A、B、C 进行PCR 扩增,在150 bp 均有淋菌CPPB 基因特异性条带(图1) ,将我科微生物室分离培养的20 株大肠埃希菌、痢疾志贺菌耐青霉素、四环素菌株用上述相同方法行PCR 扩增, 在150 bp 、224 bp 、316 bp 处均无特异性条带出现。
2. 3 临床标本培养及PCR 测定结果 取泌尿生殖道标本125 例同时进行培养、药敏和PCR ,其结果见表1 : PCR 法与培养法及PPNG、TRNG 药敏试验比较,结果显示淋菌的检出率:培养法为20 % ,PCR 法为24. 8 %;PPNG检出率:药敏法为16. 0 % ,PCR 法为20. 8 ;TRNG检出率:药敏法为14. 4 % ,PCR 法为19. 2 %。
