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分级定量PCR检测血清HBV DNA
作者:郭晏海等 来源:生物秀 时间:2006-9-11

      在定量测定时,我们采用GQS-960凝胶成像及分析系统,对待测及竞争模板的扩增带进行荧光强度比较,经微机计算出相应的待测模板拷贝数. 该方法仍采用溴化乙锭染色,紫外灯下测定荧光. 因此过去有定性PCR设备的实验室,只需购买一套凝胶荧光强度检测仪就可以开展工作. 该定量法不需象以往竞争PCR定量方法那样,测定一个样品DNA要有一系列稀释的竞争模板来标定,而是只要作3个定量(与102,104,106cop竞争模板混合)反应就可最终定出待测DNA模板的拷贝数. 用该方法分别对12份HBeAg阳性和12份HBeAb阳性血清进行定量分析,结果前12份血清均可检测到HBV DNA,并且血清浓度为6×107~1×1011cop/L. 而后12份只检出7份HBV DNA阳性,其在血清中的含量在2×105~3×108 cop/L之间,还有5份血清用该PCR方法未检出HBV DNA. 以上定量结果与文献报道的相近[3]. 上述结果也说明了为什么用简便的处理血清方法进行PCR扩增时,HBeAb阳性血清大部分往往检测不到HBV DNA的原因. 因为一般抗HBeAb阳性血清中HBV DNA含量较低(在3×108 cop/L以下),而简便血清处理方法最多只取相当于2μL血清中的HBV DNA作PCR扩增,按上面结果计算只含有0.4~6×102 cop. 因此就有一大部分不能被检测出来.
      总之,该方法操作简便,结果准确,可用于临床定量检测各种病原体的DNA.

    作者简介:郭晏海,男,1964-12-30生,河南省封丘人,汉族. 1989年西安医科大学本科毕业,1995年西安医科大学硕士,讲师,主要从事肝炎病毒基因诊断研究,发表论文18篇.
    通讯作者 郭晏海,710033,第四军医大学全军基因诊断技术研究所,陕西省西安市长乐西路17号.
    Correspondence to:GUO Yan-Hai, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
    Tel. +86.29.3216587

    作者单位:郭晏海 闫小君 苏成芝  第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
    任峰玲  西安医科大学环境卫生教研室 陕西省西安市 710061

    4 参考文献

     [1] Kumar U, Thomas HC, Monjardino B. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J Virol Methods, 1994;47:95-102
     [2] Chomczynski P, Sacch NA. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Anal Biochem, 1987;162:156-159
     [3] 林万明主编. PCR技术操作和临床应用指南. 第1版. 北京:人民军医出版社,1995:6-10
    4 Krick LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem, 1991;37:1472-1481
     [5] Martin CS, Butler L, Bron SI. Quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 1995;18:908-913
     [6] 陈波,成志恒,朱剑锋,杨蓓蕾,陈常庆. 一种检测聚合酶链反应产物的新方法. 中华医学检验杂志,1996;19:151-159
     [7] Baccard-Longere M, Alpha-Bazin B, Chypre C. Fast solid support detection of human papillomavirus in in vitro amplified DNA using a DNA-anti DNP monoclonal antibody couple. J virol Methods, 1994;46:29-38

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