1.2 方法 含靶序列的PUC 19质粒和竞争序列的PUC19质粒，将B1，B2引物扩增HBV DNA的产物克隆入PUC19，该质粒作模拟靶序列用；竞争模板是在正常的B1，B2引物扩增产物中央部插入一段人工合成的40bp的DNA片段，并克隆于PUC19，该质粒作定量实验的竞争模板. 血清处理，主要按酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法［2］提取血清中HBV DNA，血清用量为300μL，最后所得HBV DNA等分3份作定量PCR扩增. PCR扩增取上述纯化的HBV DNA(各5μL)分别加入三个定量反应管中，其中的竞争模板量分别为102cop,104cop,106cop. PCR反应成分为50mmol/L KCl，100mmol/LTris-HCl pH 8.3，1.5mmol/L MgCl2， 200μmol/L dNTP，B1，B2引物各30pmol. Taq DNA聚合酶1U，反应总体积30μL. 反应程序为：94℃预变性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s, 72℃ 50s分别循环40次，30次，20次后，72℃延伸5min，最后各准确取10μL PCR反应产物，进行40g/L琼脂糖凝胶电泳［3］. 荧光强度测定：将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶呈像分析系统上进行扫描，测定荧光强度比值［4，5］，并用微机计算结果.
2 结果
2.1 竞争模板与待测模板扩增效率比较 对3个待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度比分别为10∶1；1∶1；1∶10的反应液进行106倍稀释，再各取3μL稀释后溶液进行PCR扩增，循环30次，结果两者荧光强度之比仍为10∶1；1∶1；1∶10. 说明所用引物对待测模板与竞争模板的扩增效率相等.
2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 将提取并纯化的含有两种模板的两种质粒定量后，按2×105，2×104，2×103，2×102，20 cop分别进行PCR扩增反应，扩增40次循环，结果两种模板都被检测到20 cop的模板量.
2.3 标准曲线
2.3.1 标准曲线1 将102 cop的竞争模板分别与20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，2000，4000 cop的待测模板(含靶序列的PUC19质粒)混合后进行40次PCR扩增. 测定待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度之比(Ax/Ao)，并以1g(Ax/Ao)作纵坐标，以待测模板初始量的对数lgX为横坐标作标准曲线1(以下作法相同).
2.3.2 标准曲线2 将104 cop的竞争模板分别1×103，2×103，4×103，6×103，8×103，1×104，2×104，4×104，6×104，8×104，1×105，2×105，4×105 cop待测模板混合后，分别进行30次PCR扩增，作标准曲线2.
2.3.3 标准曲线3 将106 cop的竞争模板分别1×105，2×105，4×105，6×105，8×105，1×106，2×106，4×106，6×106，8×106，1×107，2×107，4×107 cop的待测模板混合后，分别进行20次PCR扩增，作标准曲线3.
