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临床样本DNA模板的常规制备方法
作者:未知 来源:飞捷生物 时间:2006-9-11

    一、   病毒标本中提取DNA(支原体、腺病毒)处理方法
    (1)将擦拭过的咽拭纸放入1.5ml装有1ml生理盐水的eppendorf管中。
    (2)以10,000r/min离心5分钟,去上清液。
    (3)沉淀物加入30 ml TE液混匀后煮沸10分钟,4℃保存备用。
    二、 从细菌中提取DNA
    1.NG(淋球菌)DNA的提取
    标本可取自尿道、生殖道或结膜分泌物。
    (1)取男性尿道口或女性宫颈处分泌物于事先加有1ml生理盐水的eppendorf管内。
    (2)振荡棉签或拭纸使NG释放出来。 

    (8)加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
    (9)去乙醇,空气干燥后加入30μl的TE液,置4℃冰箱保存备用。
    2.TB(结核杆菌)DNA的提取
    临床标本可来源于痰、尿、支气管灌洗液、胸水、腹水、心包积液等。处理方法也不尽相同,除痰标本外,其他标本大致相同。注意痰标本的留取一定要取次日早上的晨痰,留存器皿要无菌消毒,避免污染。
    (1)痰标本TB DNA的提取
    ①挑少许痰液放入1.5ml的eppendorf管中,加入5mo1/L NaOH 500μl混匀,使痰液变稀,室温中摇动20分钟。
    ②加入1mo1/L NaH2PO4  600μl混匀(起中和作用),10,000r/min离心5分钟。
    ③去上清液,补加TE至500μl混匀,加少许溶菌酶。
    ④置37℃消化30分钟。
    ⑤加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液,摇匀20分钟。
    ⑥10,000r/min离心5分钟,将上清液移至另一干净eppendorf管中,加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液,继续摇匀20分钟。
    ⑦10,000r/min离心5分钟,移上清液于另一小管中,加入等体积异丙醇摇匀。
    ⑧10,000r/min离心5分钟,去上清液,置空气中干燥,加入30μlTE溶解沉淀物,置4℃冰箱备用。
    (2)胸水、腹水、支气管灌洗液、尿液、心包积液标本TB DNA的提取
    ①将上述液体3ml,经反复离心,去上清液,留沉淀物。
    ②按上述痰标本处理操作步骤③-⑧提取。
    三、组织内基因DNA的提取
    1.HPV(尖锐湿疣)提取
    (1)取绿豆大小的组织样品于1.5ml的eppendorf管中,加入细胞裂解液少许,裂解液含0.1mo1/L NaC1、0.2mol/L蔗糖、0.01 mol/L EDTA、0.3mol/L tris(pH8.0)和0.5%-1% SDS。
    (2)用眼科剪剪碎组织(越细越好),补足裂解液至400μl,并搅散组织块。
    (3)置60℃—65℃水浴消化2-3小时,中间摇匀两次。
    (4)加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液抽提,摇匀20分钟。
    (5)10,000r/min离心5分钟,上清液移入新的eppendorf管中,用两倍体积的乙醇沉淀DNA。
    (6)10,000r/min离心5分钟,去上清液,空气干燥沉淀物,加入30μl的TE,置4℃保存备用。
    2.各种肿瘤组织提取(胃、肠、心肌、骨骼肌、肝、腺癌、子宫、绒毛等)

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