2. 重复性问题：重复性是判断实验结果优劣的重要指标，其主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）。对于特定的分析系统，重复性的高低决定了PCR反应能检测出样本中目的基因的初始浓度变化的最小值。由于PCR反应本身具有不精确扩增的特性，它所造成的结果精确性要远小于经典的临床化学检验和免疫分析。对于绝大多数实验，一般都可以计算出所设计体系能检测出样本初始浓度的最小值，根据多次实验可以求得该最小值的变异情况和它的可信区间范围，变异越小或是可信区间范围越小，说明这一反应体系的精确度越高。在实时定量PCR过程中，从样本的准备到扩增，再到定量的进行，实验中的每个方面都与实验的重复性息息相关，除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，影响结果重复性较为关键的因素还包括（1）PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。（2）目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。（3）标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。
3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统的终点定量PCR 大约250倍。在理论上，只要设计的引物对目的基因有足够的特异性，PCR 应可检测出只含一个拷贝目的基因的样本，也的确有人报导在特定的反应条件下，实时定量PCR 可以检测出单细胞水平的基因组DNA[11]，但是在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg到fg级，对于病毒、质粒而言，其检出限一般在102-103拷贝数以上[8]。影响实时定量PCR 敏感性的因素众多，除了对一般PCR反应均存在的影响因素如反应体系、Taq酶的活性之外,实时定量PCR还有其特殊的影响因素，包括：
(1)反应体系中形成的引物二聚体的影响：引物二聚体是非特异性退火和延伸的产物,它的形成不仅会影响到扩增的效率,而且由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的形成，但是在定量检测时，它却可以避开引物二聚体的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体的是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成，另外Lightcycler提供一种Taq酶的抗体，在PCR反应的最初阶段，这种抗体能阻断Taq酶的作用，但是当反应温度达到70度时，它便失活，使Taq酶开始发挥作用，在反应体系中加入这一抗体的目的也就是使要在反应达到较高温度时，才开始PCR扩增，从而避免反应初始阶段引物二聚体的形成。第三，要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3’端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。第四，如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。最后，在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。
（2）循环数：一般的实时定量PCR反应只须25－30个循环便可获得满意的结果，但是对于那些极微量的待测样本而言，适当增加循环数可以提高反应的检出限，有文献报导当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。但是并非循环数增加得越多，其敏感性就会越高，实际上，当循环数增加到某一值时，敏感性便不再升高，因为循环数并不是影响敏感性的唯一因素，而且在实验过程中，也不可能因为增加敏感性而无限制地增加循环数，这不仅是实践中行不通，而且在理论上也不可行，因为随着循环数的增加，一方面，聚积的产物会抑制Taq酶的活性，另一方面，也会增加形成异源二聚体的可能性，这些都会影响到最终的定量结果。
（3）Mg2＋的浓度：根据Roche公司的Lightcycler3.5版本技术说明，Mg2+的浓度将影响到实时定量PCR的敏感性，其推荐使用的浓度为3mM。Mg2+浓度对敏感性的影响主要存在于两方面，首先，Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2+的浓度无法达到使Taq酶发挥最佳活性，无疑将会影响到实时定量的敏感性；其次，Mg2+的浓度过高，会增加引物二聚体的形成，从而导致敏感性降低。所以在反应中选择合适的Mg2+浓度条件，是相当重要的。
