5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光[35]。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性[36]。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响[37]。
实践中的问题：
实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。
1. 方法的选择：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对目的基因的表达差异有直接的反映[38]。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA[39]。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增，使用的荧光材料可以是杂交探针、水解探针或是SYBR Green I。有研究表明[40]，这一方法的动力学范围可以达到9个数量级，远比终点法的要高。这一方法虽然简便，但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和模板的准备过程。就标准品而言，实践中有外参照和内参照之分，作为外参照的标准品与目的基因不在同一反应体系中进行扩增，所以它无法检测也不可能补偿可能出现在目的基因反应体系中的影响因素，如PCR抑制子[41]。事实上，在绝大多数的实验中，要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品作为外参照的不足，研究者便引入一个内参照同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR。竞争性PCR 所使用的内参照具有与目的基因序列相同的引物结合位点，但不具有相同的探针结合位点[42]。关于内参照的设计，有多种方法可供选择，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突变[43]，改变目的基因中的某些核苷酸[44]，设计不同的限制性酶识别位点[45]，也可以用非特异的间隔基因或间隔DNA 作为内参照[46]。竞争性PCR 设计的原理在于内参照与目的基因相互竞争反应的原料，所以两者的量应当相互匹配，如果一方的拷贝数大大的高于另一方，那么拷贝数多的一方就会在反应体系中得到优先扩增，而拷贝数少的一方则扩增受到抑制，定量也就不能有效地进行。由于使用了内对照，所以一旦体系中存在干扰PCR扩增的因素，就会通过内对照的扩增效率的变化反映出来，目前使用的实时定量PCR仪都是以扩增曲线上crossing point的漂移来体现扩增效率的变化的。竞争性PCR 由于能够消除反应体系中干扰因素的影响，所以它所等到的结果要准确可靠得多，但是由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比单使用外参要大为缩小，往往只有2-3个数量级[40]。正是由于竞争性PCR 有利有辟，所以研究者应根据不同的情况决定是否使用内参照。
在目前的研究中，大多数研究者选择使用绝对定量的方法，但是也有学者[47]认为在当前的条件下，绝对定量具有难以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀释浓度的标准品不仅费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。（2）标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。（3）每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR 的高通量有所降低。（4）由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。鉴于以上原因，这些学者强烈地推荐使用相对定量的方法，所谓相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3）标准化标本[47]。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因的同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。除了这种常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]设计了一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达，他们根据数学推导得出目的基因的量=2-^^Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照，所以，2-^^Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，所以这一方法更为简便省时。统计学结果表明这一方法的结果也是相当可靠的。
总之，相对定量不仅比绝对定量更加简单，经济（如果不做标准曲线），而且也更为可靠和准确，因为存在于反应体系中的干扰因素，如样本不纯、试剂影响等都可以通过数学处理而去除。
