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RNA Extraction (mini prep):Trizol法
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-9
    RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调控和cDNA的合成都是必须的,RNA的纯度和完整性对于Northern blot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多,其中最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染

    实验原理:
    Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
    用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少,可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA,体外翻译和分子克隆等。

    实验步骤:
    1.液氮研磨样植物叶片,每1.5ml tube分装0.1克样品;
    2.每管加1毫升Trizol 试剂(样品体积不超过Trizol 试剂体积的10%),迅速混匀(若样品较多可先将混好的样品置于冰上);室温下净置5-10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离;

    7.弃上清,加1ml 75%乙醇清洗RNA,振荡片刻后(务必使沉淀悬浮起来,以确保洗涤干净),7500×g 离心5分钟,小心弃上清;
    8.室温静置5-15分,使RNA沉淀恰好干燥,加入20 µl DEPC水溶解,取2 µl 琼脂糖电泳检测RNA质量。采用分光光度计测定RNA浓度,将样品保存于-70 ℃超低温冰箱中备用。
     
    注意事项:

    抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染,因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。
    RNase-free water:Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate (DEPC)to 0.01% . Let stand overnight and autoclave. 
    研钵处理:0.4N NaOH 浸泡过夜,DEPC水洗涤3遍;
    应戴口罩和手套,环境洁净;玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上;塑料制品DEPC水清洗,蛋白质变性剂处理;一次性用品如tube,tip等用新的,高温高压消毒。
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