3 NucliSens HIV-1实验
是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。
最近NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(real-time)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本的拷贝数（cp/ml）改变为每毫升国际单位（IU/ml）。这个实验的优点是使用的样品量较少（标准是1.0ml，0.01-2.0ml均可）、有广泛的动态范围（50-3000000IU/ml）、反应快（2小时可以检测48份标本）、特异性可以达到99.7%（95％的可信限是98.5%-100%）、精密性1000－3000000IU/ml是0.12log、≤1000IU/ml是0.28log。反应在一只管子内完成、不需要温度循环、提取的RNA相对较纯、不受抑制PCR扩增的干扰物质影响等等。除血浆以外，这个方法还可以用来测定组织中的病毒载量。
4 不同方法的比较
三种测定病毒载量的方法都有各自的源于方法本身的优势和不足（表1）。大量配对比较实验表明，在允许的动态范围内三种方法测定的结果有高度相关性，也都具有较高的敏感性和重复性，抗病毒治疗以后血浆病毒载量的变化用三种方法测量的结果也是相似的。但是三种方法测定的绝对值却不能直接比较，不同方法间的变异可以达到0.08-0.26log （1.2-1.9倍）。在澳大利亚进行的一项评估显示，Amplicor HIV-1 Monitor 1.0和HIV-1 Quantiplex 2.0的变异系数分别是53-87%和22-31%，Amplicor HIV-1 Monitor 1.5和HIV-1 Quantiplex 3.0的变异系数分别是82-86%和16-23%，这些结果提示即使使用最新版本的检测试剂，不同的实验室和不同方法之间仍然有很大的差别，因此检测病毒载量必须始终在相同的实验使用相同的方法。
表1 三种病毒载量测定方法的比较
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方 法 |
Quantiplex HIV-1 RNA |
Amplicor HIV-1 Monitor |
NucliSens HIV-1 QT |
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原 理 |
bDNA |
RT-PCR |
NASBA |
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检测范围 |
50-500000cp/ml |
400-750000cp/ml 50-75000cp/ml（超敏） |
50-3000000cp/ml |
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检测亚型 |
A-G |
A-G |
A-G |
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标本量 |
1ml |
0.2ml |
10μl-2ml |
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优 点 |
FDA批准，不需要RNA提取和纯化，需时间短、出结果快 |
FDA批准 |
可以检测组织和体液中的病毒载量，具有最大的检测范围。 |
三种病毒载量测定方法都具有高度的特异性，未感染的标本几乎都可以得出100%的阴性结果。但是在有些情况下，由于污染或非特异交叉也可能出现假阳性结果。因此，没有一种病毒载量测定方法被FDA批准用来做HIV感染的诊断，最可靠的诊断方法还是血清学方法。
5 病毒载量测定结果的国际单位
由于不同病毒载量测定结果存在较大变异，为了增强可比性、便于不同实验室和不同方法的比较，WHO组织了10个国家26个实验室的协作研究，利用人工制备的三种标准品建立了病毒载量测定结果的国际标准。本次研究的结果显示，含量为100000IU/ml的标本用bDNA、Monitor和NucliSens三种方法检测的结果分别是4.61log(4.51log-4.69log)、4.71log(4.37log-5.16log)和 5.01log (4.94log-5.12log)，也就是国际单位（IU）与拷贝数（cp/ml）的换算大约是1：0.92～1:1.00。
