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重组质粒的筛选
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-9-7

    重组DNA转化受体细胞后,须在不同水平上进行筛选,以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中,并非每个受体细胞都被转化;即使获得转化细胞,也并非都含有目的基因,所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。
    一、抗生素平板筛选
    【实验原理】
    目标基因是Kan的抗性基因,而载体含Amp 的抗性基因,因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。
    【操作步骤】
    1.制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板 
    2.将100μl 转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上,37℃培养12-16h 。
    3.在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。
    4.小量制备质粒,限制性酶切分析进一步鉴定。
    二、α互补筛选
    【实验原理】
    适用于含有半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体,如 pUC系列等,其原理是:载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后(质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性),它们可以融为一体,形成具有酶学活性的蛋白质,这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac+ 细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此,带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析,即可确定这些质粒的结构。

    【试剂】
    1.X-gal(20mg/m l):将20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中,-20℃避光保存。
    2.IPTG(200mg/ml):将1g IPTG溶于4 ml去离子双蒸水中,定容至5 ml,用0.22μm过滤器除菌,-20℃保存备用。
    【操作步骤】
    1.制备含相应抗生素的琼脂平板。
    2.于平板表面加 X-gal 40μl 和IPTG 4μl,并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。37℃静置l h。
    3. 将100μl 转化的菌液涂布于平板表面,置37℃培养箱20 min后,倒置平板继续培养12~16h。
    4.中止培养后,将平板静置4℃ 4h,使蓝色充分显现,平皿上显示蓝色和白色两种菌落。
    5.挑取白色菌落置2 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃摇床培养8~12h。
    6.提取质粒,以限制性酶切分析进一步鉴定。

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