在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。
由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。
磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。
缓冲液的pH值由哪些因素决定？
设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为[酸]，弱酸盐的浓度为[盐]，则由弱酸的电离平衡式可得下式：
根据此式可得出下列几点结论：
（1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。
（2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。
（3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。
从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出[盐]和[酸]的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为:
需Na2HPO4量为 :
计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等。
（1）醋酸盐缓冲溶液
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PH |
M/S 醋酸钠 (毫升数) |
M/S 醋酸 (毫升数) |
PH |
M/S 醋酸钠 (毫升数) |
M/S 醋酸 (毫升数) |
PH |
M/S 醋酸钠 (毫升数) |
M/S 醋酸 (毫升数) |
|
3.2 |
1 |
32 |
|
|
|
|
|
|
|
3.4 |
1 |
16 |
4.4 |
9.4 |
12.6 |
5.4 |
17.1 |
2.9 |
|
3.6 |
1.5 |
18.5 |
4.6 |
9.8 |
10.2 |
5.6 |
18.1 |
1.9 |
|
3.8 |
2.4 |
17.6 |
4.8 |
12.0 |
8.0 |
5.9 |
19 |
1 |
|
4.0 |
3.6 |
16.4 |
5.0 |
14.1 |
5.9 |
6.2 |
19.9 |
0.1 |
|
4.2 |
5.3 |
14.7 |
5.2 |
15.8 |
4.2 |
|
|
|
（2）磷酸盐缓冲液的配制
1/15M的Na2HPO4溶液（11.876克纯的Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）及1/15M的KH2PO4溶液（将9.078克KH2PO4溶于1升水中）将着两种溶液依不同比例混合。
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PH |
Na2HPO4 （ml） |
KH2PO4 （ml） |
PH |
Na2HPO4 （ml） |
KH2PO4 （ml） |
PH |
Na2HPO4 （ml） |
KH2PO4 （ml） |
|
4.94 |
0.1 |
9.90 |
6.46 |
4.00 |
6.00 |
7.73 |
9.00 |
1.00 |
|
5.29 |
0.25 |
9.75 |
6.81 |
5.00 |
5.00 |
8.04 |
9.50 |
0.50 |
|
5.39 |
0.50 |
9.50 |
6.98 |
6.00 |
4.00 |
8.34 |
9.75 |
0.25 |
|
5.91 |
1.00 |
9.00 |
7.17 |
7.00 |
3.00 |
8.69 |
9.90 |
0.10 |
|
6.24 |
2.00 |
8.00 |
7.38 |
8.00 |
2.00 |
9.18 |
10.00 |
0.00 |
|
6.47 |
3.00 |
7.00 |
|
|
|
|
|
|
(3)Tris缓冲溶液
贮备液
溶液A：0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷）
溶液B：0.2M HCl
50mlA＋XmlB，用蒸馏水稀释到200ml
|
pH |
X（ml） |
pH |
X（ml） |
|
7.2 |
44.2 |
8.2 |
21.9 |
|
7.4 |
41.4 |
8.4 |
16.5 |
|
7.6 |
38.4 |
8.6 |
12.2 |
|
7.8 |
32.5 |
8.8 |
8.1 |
|
8.0 |
26.8 |
9.0 |
5.0 |
（4）磷酸盐－柠檬酸缓冲液的配制
0.2M Na2HPO4·2H2O溶液及0.1M柠檬酸溶液，并依不同比例混合（见表）
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pH |
Na2HPO4 （ml） |
柠檬酸 （ml） |
pH |
Na2HPO4 （ml） |
柠檬酸 （ml） |
|
2.2 |
0.40 |
19.60 |
5.2 |
10.72 |
9.28 |
|
2.4 |
1.14 |
13.76 |
5.4 |
11.15 |
8.85 |
|
2.6 |
2.18 |
17.82 |
5.6 |
11.60 |
8.40 |
|
2.8 |
3.17 |
16.83 |
5.8 |
12.09 |
7.91 |
|
3.0 |
4.11 |
15.89 |
6.0 |
12.63 |
7.37 |
|
3.2 |
1.94 |
15.06 |
6.2 |
13.22 |
6.78 |
|
3.4 |
5.70 |
14.30 |
6.4 |
13.85 |
6.15 |
|
3.6 |
6.44 |
13.56 |
6.6 |
14.55 |
5.45 |
|
3.8 |
7.10 |
12.90 |
6.8 |
15.45 |
4.55 |
|
4.0 |
7.71 |
12.29 |
7.0 |
16.47 |
3.53 |
|
4.2 |
8.28 |
11.78 |
7.2 |
17.39 |
2.61 |
|
4.4 |
8.82 |
11.18 |
7.4 |
18.17 |
1.83 |
|
4.6 |
9.35 |
10.85 |
7.6 |
18.73 |
1.27 |
|
4.8 |
9.86 |
10.14 |
7.8 |
19.15 |
0.85 |
|
5.0 |
0.30 |
9.70 |
8.0 |
19.45 |
0.55 |
(5)盐缓冲液的配制
a、M/20硼砂（10.108克Na2B4O7·10H2O溶在一升水中）
b、M/5硼酸＋M/20NaCl（12.45克H2BO＋2.925克）NaCl在一升水中（见下表）
|
pH |
a(ml) |
b(ml) |
pH |
a(ml) |
b(ml) |
|
7.0 |
0.45 |
9.55 |
8.2 |
3.5 |
6.5 |
|
7.2 |
0.75 |
9.25 |
8.4 |
4.45 |
5.55 |
|
7.3 |
1.10 |
8.9 |
8.6 |
5.5 |
4.5 |
|
7.8 |
2.05 |
7.95 |
9.0 |
8.2 |
1.8 |
|
8.0 |
2.70 |
7.3 |
|
|
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