两种方法，一是制作电解质浓度梯度，即离子强度梯度。通过不断增加离子强度，吸附到交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞争性的洗脱下来；二是制作pH梯度，影响样品电离能力，也使交换剂与样品离子亲和力下降，当pH梯度接近各样品离子的等电点时，该离子就被洗脱下来。在实际工作中，离子强度梯度和pH梯度可以是连续的（称连续梯度洗脱），也可以是不连续的（称阶段洗脱）。
一般来讲，前者分离的效果比后者的分离效果理想，梯度洗脱需要梯度混合器来制造离子强度梯度或pH梯度。
图3-6为最简单的一种梯度混合器，它由两个容器组成，两容器之间以连通管相连接，与出口连接的容器装有搅拌装置，内盛起始洗脱液，此洗脱液代表开始洗脱的离子强度（或起始pH）；另一容器内盛有终末洗脱液，此洗脱液代表洗脱的最后离子强度(或最后pH)。在洗脱过程中，由于终末洗脱液不断进入起始洗脱液中，并不断被搅拌均匀，所以流出的洗脱液成分不断的由起始状态向终末状态演变形成连续的梯度变化。
四、凝胶过滤(Gel Filtration)
凝胶过滤是利用具有一定口径范围的多孔凝胶的分子筛作用对生物大分子进行分离的层析技术。当样品随流动相经过由凝胶组成的固定相时，分子量大的物质不能扩散进入凝胶颗粒内部，于是随流动相流经颗粒之间的狭窄空隙，首先洗脱出层析柱；分子量小的物质可以扩散进入凝胶颗粒内部，比较大分子量物质流经的载面积宽，流动速度慢，而后被洗脱出来。这样分子量大和分子量小的物质便得以分离（图3-7）。即固定相的网孔对不同分子量的样品成分具有不同的阻滞作用，使之以不同的速度通过凝胶柱，从而达到分离的目的，凝胶过滤又因此得名“分子筛层析”和“凝胶排阻层析”。
