2、试剂
1）包被液：0.05 M pH9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g, 加水至1000 mL，4℃可保存1周）。
2） 闭液：5％ 脱脂奶粉或0.3％ BSA
3）洗涤液：0.15 M pH7.4 PBS-T（0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12H2O,8 g NaCl, 0.2 g NCl,0.5mL Tween-20,加水至1000 mL，4℃保存）
4）底物液：pH5.0 的磷酸盐-柠檬酸缓冲液（0.1 M 柠檬酸24.3 mL，0.2 M磷酸盐25.7 mL，加水50 mL，混匀）， 临用前，在上述缓冲液中溶解40 毫克邻苯二胺（Ortho-Phenglendiaruine, OPD），然后加入30%双氧水0.15 毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。
5） 阳性对照液：1：100用HAT培养基稀释的小鼠血清。阴性对照液为HAT培养基
6） 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 酶标结合物。
7） 2 M H2SO4
8） 抗原溶液
四．实验步骤
1．抗原包被
取洁净的聚苯乙烯微量酶标板，于每孔内加抗原0.1 毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白
含量10μg/mL），置4℃过夜，用洗涤液洗3 次，每次3 min。
2．封闭
每孔加封闭液100μL，37℃放置30 min。洗涤3 次。
3．加待测血清
于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各100 μL。置37℃ 60 min，洗涤3次。
4．加酶标抗体（二抗）于每孔加酶标抗体各100 μL，置37℃ 60min，洗涤3 次。
5．加临时配制的底物液各100 μL，置暗处15分钟。加2M 硫酸50μL 终止反应。
5．结果判断：（肉眼判断）
若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表示。
注意事项
1、实验时，应分别以阳性与阴性对照控制实验条件，待检样品应一式两份，以保证实验结果的准确性，有时本底高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2、在ELISA中，进行各项实验条件的选择非常重要，如：固相载体的选择：很多物质可
作固相载体，如聚氯乙稀、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素等，可以是凹平板、试管、珠粒等。目前常用的96 孔板为聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，使用前均进行筛选，用等量的抗原包被，同样条件下比较不同载体的均一性和吸附性能。
包被抗体（或抗原）的选择： 将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度好，pH 值适当，吸附时间和蛋白量也有一定的影响。最好通过滴定确定蛋白包被的最佳浓度。
酶的底物和共氢体的选择：共氢体要求廉价、安全、有明显的显色反应，而本身无色。如OPD 有潜在的致癌性，应注意防护。TMB 和ASTS 是目前较满意的共氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常地位作用时间为10～30 min为宜。底物使用液应该新鲜配制。
