(二) 报告基因检测法
报告基因(reporter gene)是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。可见报告基因实质是起到了判断目的基因是否已经成功的导入到受体细胞并且表达的标记基因的作用。
作为理想的植物报告基因应具备以下特征： ①编码的产物是惟一的，并且对受体细胞无毒；②表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞内不存在，即无背景；③产物表达水平稳定，便于检测等。转基因植物常用的报告基因主要有β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶(β-glucuronidase, gus)基因(gus)、胭脂碱合成酶(nopaline synthase, nos)基因(nos)、章鱼碱合成酶(octopine synthase, ocs)基因(ocs)、荧光素酶(luciferase, luc)基因(luc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因(gfp)等。
1 gus基因的检测
应用较为广泛的报告基因是基因，它来自于大肠杆菌，编码β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶。该酶与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid,X-Gluc)底物发生作用，产生蓝色沉淀反应，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。检测容易、迅速并能当量。只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。
2 nos和ocs基因的检测
胭脂碱合成酶催化冠瘿缄的前体物质精氨酸与α-酮戊二酸进行缩合反应，生成胭脂碱。章鱼碱合成酶催化精氨酸与丙酮酸缩合生成章鱼碱。目前主要采用纸电泳法检测nos 和ocs基因。纸电泳分离被检植物组织抽提物，精氨酸的电泳迁移率最大，章鱼碱的迁移率略大于胭脂碱。电泳后用菲醌染色。菲酚与精氨酸、胭脂碱、章鱼碱作用后在紫外光下显示黄色荧光，放置两天后变为蓝色。
用作报告基因的荧光素酶基因主要来自细菌和荧火虫。细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，
在还原型黄素单核苷酸参与下，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。荧火虫荧光酶在镁离子、三磷酸腺苷和氧的作用下，催化6-羟基喹啉类物质生成氧化荧光素，同时放出光子。依据上述原理建立的荧光素酶基因的检测方法简便、灵敏。
3 绿色荧光蛋白基因
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离纯化出一种可以发出绿色荧光的物质。与其他选择标记相比，GFP 的检测具有不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点。同时GFP 生色基团的形成无种属特异性，在原核和真核细胞中都能表达，其表达产物对细胞没有毒害作用，并且不影响细胞的正常生长和功能。所以利用gfp作为选择标记基因，可以很方便的从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株，并且可用来追踪外源基因的分离情况。
总则，为了获得真正的转基因植株，进行基因转化后的筛选和鉴定工作包括以下步骤：
第一步工作是筛选转化细胞。在含有选择压的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转基因植株；第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定，通过Southern杂交证明外源基因在植物染色体的整合，通过原位杂交可缺点外源基因在染色体上整合的位点及其整入的外源基因的拷贝数。通过Northern 杂交可以证明外源基因在植物细胞内是否正常转录，生成特异的mRNA。通过Western杂交可证明外源基因在植物细胞内转录及翻译成功，生成特异的蛋白质。第三步则是进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究。转基因植物应具有由外源基因编码的特异蛋白质影响代谢而产生该植物不具备的目标经济性状，这样才达到转基因的目的；第四步则是遗传学分析，分析外源目的基因及其控制的目标性状能否稳定遗传？以及遵守什么遗传规律。最后是获得转基因植物品种，应用于生产。
三. 实验方法
由于根癌农杆菌介导转化法操作简便、成本低、转化率高，是目前应用最广泛的转基因方法。因此本实验主要以根癌农杆菌介导转化法为主学习植物转基因技术的原理和方法，以及转基因植物的筛选和鉴定的基本过程。至于其他方法如有机会，可到其他单位进行参观学习。
1. 仪器
(1) 超净工作台
(2 )高压灭菌锅
(3) 恒温摇床
(4) 台式离心机
(5) 冷冻台式离心机
(6) 超速冷冻离心机
(7) 紫外/可见分光光度计
(8) PCR扩增仪
(9) 电泳仪及水平电泳槽
(10) 紫外投射仪
(11) 自动双蒸纯水蒸馏器
(12) 光照培养箱
2. 实验材料
(1) 植物材料：甘蓝型油菜(Brassica napus L) “四月慢”种子
(2) 菌株及质粒：根瘤农杆菌菌株为EHA105。质粒为携带SsN HX1 基因的PROK2。由于PROK2质粒本身带有NPT II基因，因此表现为卡那霉素抗性。
